表达PEDV保护性抗原靶向融合肽乳酸杆菌活菌载体的构建及其免疫原性分析

发布时间：2018-01-03 07:40

本文关键词：表达PEDV保护性抗原靶向融合肽乳酸杆菌活菌载体的构建及其免疫原性分析　出处：《东北农业大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种肠道传染病,临床特征为严重的腹泻、呕吐以及脱水。PED可发生于各年龄段猪只,但以仔猪最为易感,死亡率高达95%以上。PEDV感染具有明显的肠嗜性,故通过黏膜免疫可有效预防本病的发生。为实现良好的肠道黏膜免疫应答,本实验以PEDV S蛋白中能够诱导机体产生中和抗体的线性表位区ps420基因片段,定向插入乳酸菌质粒表达载体,并电转化乳酸杆菌,以此作为口服制剂探索肠道黏膜对该病的特异性免疫效果。为提高抗原吸收和呈递效率,在重组乳酸菌表达载体构建中引入M细胞靶向肽基因序列co1和树突状细胞靶向肽基因序列DCpep,以增强机体的免疫应答。以临床疑似PED肠道内容物扩增获得PEDV S ps420基因片段,将其克隆到pET-32a,并转化大肠杆菌BL21(DE3),获得重组p ET-32a-ps420/BL21。经SDS-PAGE和Western blot检测,确定目的蛋白ps420得到表达。纯化回收该蛋白,用于检测脾淋巴细胞的增殖情况。以融合PCR或SOE-PCR方法引入M细胞靶向肽co1编码基因和树突状细胞靶向肽DCpep编码基因,分别获得融合基因ps420-co1、ps420-DCpep和ps420-co1-DCpep,将ps420、ps420-co1、ps420-DCpep和ps420-co1-DCpep插入乳酸杆菌组成型表面表达载体p PG-T7g10-PPT中,电转化入干酪乳杆菌L.casei 393中,得到四株阳性重组菌。重组菌分别命名为非靶向重组乳酸杆菌pPG-T7g10-PPT-ps420/L.casei 393、单靶向M细胞重组乳酸杆菌p PG-T7g10-PPT-ps420-co1/L.casei 393、单靶向树突状细胞重组乳酸杆菌p PG-T7g10-PPT-ps420-DCpep/L.casei 393和双靶向M细胞和树突状细胞重组乳酸杆菌p PG-T7g10-PPT-ps420-co1-DCpep/L.casei 393。将构建的4株重组乳酸杆菌分别于37℃静置培养约16 h,经Western blot检测,重组菌均在预期位置表达了目的蛋白;激光共聚焦显微镜定位检测结果显示,表达ps420蛋白的4株重组菌菌体表面均可见黄绿色荧光,而未表达ps420蛋白的对照菌pPG-T7g10-PPT/L.casei393则未发现黄绿色荧光,表明重组干酪乳杆菌表达了目的蛋白并被展示于菌体表面。为探讨所构建的表达PEDV S ps420蛋白的重组干酪乳杆菌对机体免疫应答水平的影响,本研究选用BALB/c小鼠为实验动物,分组口服免疫不同靶向修饰的重组干酪乳杆菌,同时以口服PBS和空载体菌p PG-T7g10-PPT/L.casei 393为对照。免疫分两种程序进行:一次免疫组和二次免疫组,接种剂量为100μL,含活菌数1×109 CFU。免疫后隔天收集小鼠新鲜粪便,每周采集小鼠血液、外生殖道黏液等样品,并在末次免疫两周后采集每组免疫鼠肠黏液。分别采用不同的方法检测抗体及细胞因子水平:ELISA检测黏液和粪便样品中特异性s IgA抗体水平和血清IgG抗体水平;MTT法检测脾淋巴细胞增殖情况;试剂盒方法检测IL-4、IFN-γ的水平。ELISA检测显示,表达PEDV S ps420不同靶向修饰的重组乳酸杆菌免疫小鼠在一免后第7d即可检测到较高的抗体水平,显著于非靶向修饰重组菌p PG-T7g10-PPT-ps420/L.casei 393免疫组(p0.05),极显著于对照组(p0.01),且双靶向修饰重组乳酸杆菌p PG-T7g10-PPT-ps420-co1-DCpep/L.casei 393的免疫效果优于单靶向修饰重组乳酸杆菌p PG-T7g10-PPT-ps420-co1/L.casei 393和p PG-T7g10-PPT-ps420-DCpep/L.casei 393;经二次免疫后,免疫组抗体水平上升明显,极显著于对照组(p0.01)。通过中和实验可知重组干酪乳杆菌诱导机体产生的血清抗体Ig G具有病毒中和活性。此外,MTT以及IL-4、IFN-γ水平检测结果显示,重组干酪乳杆菌诱导机体产生的免疫应答以Th2型细胞免疫应答为主。以上结果表明,靶向修饰的重组乳酸菌免疫原性强于未经修饰的重组乳酸菌,且双靶向修饰的重组菌的免疫效果最好。综上所述,本研究构建了表达PEDV保护性抗原的重组干酪乳杆菌,并证实M细胞与树突状细胞双靶向策略应用于乳酸菌活载体系统可诱导较强的免疫应答,为PEDV新型口服疫苗的研制提供了新思路。
[Abstract]:The recombinant plasmid pPG - T7g10 - PPT - pPG - T7g10 - PPT - co1 / L . The results showed that the immune response of recombinant Lactobacillus paracasei induced by recombinant Lactobacillus paracasei was significantly higher than that in the control group ( P 0.01 ) .

【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65

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