牛RV拮抗人源细胞RLRs信号转导通路部分关键因子的研究

发布时间：2018-01-19 21:30

  本文关键词： 轮状病毒 NSP1 先天性免疫 RLRs 拮抗机制　出处：《黑龙江八一农垦大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：轮状病毒(Rotavirus,RV)是引起婴幼儿和多种幼龄动物腹泻的主要病原之一,全世界每年因感染RV而死亡婴幼儿达50~60万。RV是人兽共患的病原体,目前尚无特效治疗药物,疫苗是预防该病的最主要手段。美国NIH基于改良的“琴纳”原理以牛RV为亲本研制的人-牛重配疫苗在非洲等地进行的临床试验发现该疫苗免疫效力尚不足50%,目前研究发现RV具有多重拮抗宿主先天性免疫的功能,疫苗免疫效力较低可能与宿主先天性免疫反应有关。RV NSP1是拮抗宿主先天性免疫的关键蛋白,具有多重功能。细胞质模式识别受体RIG-I样受体(RIG-I like receptors,RLRs)能够识别病毒双链RNA,激活下游干扰素调节因子,促进I型IFN分泌,产生先天性免疫应答。本实验以牛RV UK株为研究对象,在RNA和蛋白水平上探讨RV对人结肠腺癌细胞Caco-2的RLRs信号转导通路部分关键因子的作用机制以及NSP1蛋白对人胚胎肾细胞293T的RLRs信号转导通路部分关键因子在蛋白水平的影响。首先分别在RV UK株感染Caco-2细胞6 h、12 h和24 h后,提取总RNA,通过实时定量PCR检测RIG-I、MDA5、IRF3、IRF7及RV VP6的mRNA转录水平变化。结果发现VP6 mRNA转录水平随转染时间延长而逐渐上升,IRF3、IRF7、RIG-I和MDA5mRNA转录水平随感染时间延长表达量均略有上升,且感染早期RIG-I和MDA5相对有较明显变化。结果表明RV UK株感染激活人源细胞RLRs信号转导通路,产生宿主先天性免疫应答。另外,RV UK株感染Caco-2细胞,分别在6 h、12 h和24 h后收集细胞,通过Western blot检测细胞内源性IRF3、RIG-I和MDA5蛋白含量变化,发现IRF3蛋白含量随感染时间延长逐渐下降,RIG-I和MDA5蛋白含量随感染时间延长略有上升,表明RV UK株介导IRF3蛋白降解。为探讨在蛋白水平上NSP1蛋白对先天性免疫RLRs信号转导通路部分关键因子的影响,构建了pCMV-3×FLAG-NSP1真核表达质粒,转染293T细胞,分别在转染后4 h、8 h和12 h收集细胞,检测细胞内源性IRF3、RIG-I和MDA5蛋白含量变化。结果发现IRF3蛋白含量随转染时间延长而下降,RIG-I和MDA5蛋白无明显变化。同时构建缺失IRF3结合结构域的pCMV-3×FLAG-NSP1△IRF3真核表达质粒,转染293T细胞,分别在转染后4 h、8 h和12 h收集细胞,检测细胞内源性IRF3、RIG-I和MDA5蛋白含量变化。结果发现细胞内源性IRF3、RIG-I和MDA5随转染时间延长均无明显变化。构建pEGFP-C2-RIG-I、pEGFP-C2-MDA5和pEGFP-N3-IRF3真核表达质粒,分别与p CMV-3×FLAG-NSP1真核表达质粒共转染293T细胞,分别在转染后4 h、8 h和12 h收集细胞,检测IRF3、RIG-I和MDA5蛋白含量变化,发现IRF3蛋白含量随转染时间延长而下降,RIG-I和MDA5蛋白含量随转染时间延长而上升,进一步表明NSP1蛋白介导IRF3蛋白降解。在转染之前,通过蛋白酶体抑制剂MG132预处理293T细胞1 h,pCMV-3×FLAG-NSP1质粒单独转染组内源性IRF3蛋白含量未发生明显变化;pCMV-3×FLAG-NSP1与pEGFP-N3-IRF3质粒共转染组中NSP1和IRF3蛋白含量均随转染时间延长而上升,表明NSP1是依赖蛋白酶体途径介导IRF3蛋白降解。实验结果表明,RV UK株感染Caco-2细胞后,细胞模式识别受体RIG-I和MDA5识别出RV,表达量上升,诱导RLRs信号转导通路激活,产生宿主先天性免疫应答,但RV NSP1蛋白介导下游信号分子IRF3的降解,一定程度上拮抗宿主先天性免疫应答,且NSP1是通过蛋白酶体依赖的途径介导IRF3蛋白的降解,并需要其IRF3结合结构域的参与。通过RV UK株对人源宿主先天性免疫RLRs信号转导通路拮抗机制的研究,为探讨以其为亲本的重配疫苗免疫效果不理想的原因提供依据,为研制通过弱化NSP1介导降解IRF3和依赖蛋白酶体功能的新型重组疫苗和靶向药物提供方向,为该毒株分子生物学研究提供理论参考。
[Abstract]:RF3 , IRF7 , IRF3 , IRF7 and RV VP6 mRNA transcript levels of human colon adenocarcinoma cell Caco - 2 were detected by means of real - time quantitative PCR . The results showed that NSP1 and MDA5 protein levels decreased with the time of transfection .

【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.65

【参考文献】

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本文编号：1445600