犬弓形虫抗体金标试纸条的研制

发布时间：2018-01-20 00:52

  本文关键词： 弓形虫 ELISA 胶体金 GRA7　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：弓形虫病是由弓形虫引起的一种世界范围流行的人兽共患寄生虫病,几乎能感染所有温血动物及部分冷血动物,宿主范围广泛。该病一方面会引起妊娠阶段孕妇流产,胎儿畸形、先天性缺陷或死胎,造成严重后果;另一方面还会导致艾滋病患者、癌症患者等免疫力低下人群出现心肌炎、肺炎或致死性脑炎等。人主要通过摄入含有弓形虫包囊的未煮熟的动物肉类及被弓形虫卵囊污染的水果、蔬菜、饮用水而感染弓形虫。因此,对动物弓形虫感染的监控与预防可有效控制弓形虫的传播流行。犬在弓形虫的生活史中扮演着重要角色,首先,犬可通过接触猫粪便而将弓形虫卵囊携带至人类生活区;其次,如果人类食入含有包囊的犬肉则会有感染弓形虫的可能。目前,弓形虫病临床血清学诊断方法主要有改良凝集试验(MAT)、间接血凝试验(IHA)、间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等,这些方法具有较好的敏感性和特异性,但是需要在实验室条件下完成,且需要有经验的实验技术人员及相关的实验仪器、器材,实验要求高,不适合野外环境下检测。而免疫胶体金法作为新兴的快速检测方法完全有潜力承担并完成快速、简便的弓形虫病诊断任务。研究目的:原核致密颗粒蛋白GRA1、GRA7重组蛋白,建立间接ELISA方法检测犬弓形虫抗体,并与虫体裂解蛋白TLA比较评价,选出较优蛋白。利用该蛋白制备兔抗多克隆抗体,进而建立免疫胶体金快速检测方法,检测犬弓形虫抗体,为弓形虫病快速诊断提供方法。研究内容:1原核表达弓形虫重组蛋白GRA1、GRA7,建立犬弓形虫抗体间接ELISA方法,选出较优重组蛋白抗原,用于进一步研究;2用选出的重组蛋白制备抗体、纯化浓缩验证多抗反应性;3制备犬弓形虫抗体金标试纸条,并进行评价。研究方法:1弓形虫致密颗粒蛋白GRA1、GRA7的表达与纯化将实验室保种的含有重组质粒p ET28-GRA1的大肠杆菌DE3菌株及含有重组质粒p ET28-GRA7的大肠杆菌DE3摇床培养扩增,收取菌体,用不可溶蛋白提取液裂解提取目的蛋白。将提取蛋白跑SDS-PAGE后验证蛋白大小,并将目的蛋白做Western Blot验证反应性后,透析、浓缩目的蛋白,稀释至1mg/m L,-20℃保存。2弓形虫虫体裂解抗原TLA制备将液氮保存虫体复苏接种Vero细胞后,收集弓形虫速殖子,-80℃与室温反复冻融3次后,超声破碎,吸取上清稀释至1mg/m L,-20℃保存。3犬弓形虫抗体间接ELISA方法的建立及评价分别将GRA1、GRA7、TLA蛋白按照5μg/m L,5μg/m L,10μg/m L包被酶标板,包被过夜并用脱脂奶粉封闭1h,加入待检犬血清孵育1h,HRP标记羊抗犬二抗孵育1h,加入底物显色20min,用2M硫酸终止反应后酶标仪450nm测定OD值。将ELISA检测结果与金标准方法MAT、IFA共同检测结果比较,SAS统计分析,验证建立方法可行性。并用受试工作者曲线ROC分析ELISA检测结果,评价方法稳定性及统计分析敏感性、特异性。选出较优蛋白用于制备金标试纸条。4多克隆抗体制备将0.5m L的2mg/m L目的蛋白与等体积，

本文编号：1446185