猪SLC13A5和Wnt10b基因的克

发布时间：2018-01-21 12:10

  本文关键词： 猪 SLC13A5 Wnt10b 克隆 生物信息学 组织表达谱 SNP　出处：《湖南农业大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：[目的]克隆猪SLC13A5和Wnt10b基因cDNA并分别分析其序列及其蛋白的生物学信息,以及SLC13A5和WntlOb基因分别在25日龄大白猪和沙子岭猪不同组织中mRNA的表达水平。[方法]以大白猪为研究对象,采用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends, RACE)克隆猪SLC13A5和Wnt10b基因序列,并采用生物信息学方法对两基因cDNA序列及其蛋白功能进行预测和分析,利用实时荧光定量PCR技术检测与分析不同猪种、不同组织中SLC13A5和Wnt10b基因mRNA的表达水平。利用PCR-RFLP方法在扩增目的片段发现SNP,再对猪样进行分型,计算其基因频率和基因型频率,然后再对基因型与达100kg校正日龄和校正背膘厚进行关联分析。[结论]从大白猪中获得SLC13A5基因的cDNA全长为2118 bp,包含一个1665bp ORF, 5'-UTR 557 bp和3'-UTR 1320 bp,编码554个氨基酸；猪SLC13A5基因与其它物种系统发育树,结果表明猪与家绵羊的同源性最近,与猕猴次之,与非洲爪蟾、野鸽和地山雀最远；氨基酸序列分析发现该基因编码蛋白为脂溶性蛋白,相对分子质量为61183.7 Da,理论等电点pI为7.45;预测18个潜在糖基化位点,含有8个跨膜结构域；二级结构以无规则卷曲为主,三级结构呈弯曲螺旋结构；采用荧光定量PCR分析得出同一组织SLC13A5基因在25日龄的大白猪和沙子岭猪表达差异程度不同,盲肠和背最长肌中该基因在不同品种差异极显著(P0.01),肝和腿肌中该基因在不同组织中差异显著(P0.05),以及同一品种背最长肌与其它9个组织差异显著(P0.05)；通过PCR-RFLP分析在扩增目的片段上发现突变点,该突变点位于A251G处,再对样本进行基因分型,结果表明AA、AG和GG三种基因型在校正日龄和校正背膘厚差异不显著(P0.05)。猪Wnt10b基因cDNA全长为2075 bp,包括编码区1170bp,编码389个氨基酸,同源性分析发现：猪的Wnt10b推测氨基酸序列与人、黑猩猩、小鼠、褐家鼠、马、牛、猕猴的同源性94%以上,WntlOb基因在动物进化中比较保守；氨基酸序列分析发现该基因编码的蛋白质相对分子量为42873.2 Da,理论等电点pI为9.46,属水溶性蛋白；预测含有20个磷酸化位点,预测该蛋白二级结构含有1个WNT1结构域,预测Wnt10b蛋白在脂肪的代谢和蛋白运转中起重要调节作用；通过荧光定量分析结果表明,背最长肌(P=0.0042)中Wnt10b基因在大白猪和沙子岭猪之间差异极显著(P0.01)；盲肠(P=0.0123)、小肠(P=0.0356)中WNT10B基因在两猪种表达量差异显著(P0.05)；其它组织(肾脏、心脏、肝脏、肺、腿肌)差异不显著；通过PCR-RFLP对样本进行基因分型得出,AA、AG和GG三种基因型在校正日龄和校正背膘厚差异不显著(P0.05)。[结论]本研究为进一步探讨SLC13A5和WntlOb基因在脂肪沉积机理的研究和脂肪酸代谢提供了理论基础。
[Abstract]:[Objective] to clone porcine SLC13A5 and Wnt10b gene cDNA and analyze the biological information of their sequences and proteins respectively. And the expression of SLC13A5 and WntlOb gene in different tissues of 25 day old white pig and Shailing pig respectively. [Methods] the cDNA terminal rapid Amplification of cDNA ends was used in large white pigs. The sequence of porcine SLC13A5 and Wnt10b genes was cloned by race, and the functions of cDNA sequences and their proteins were predicted and analyzed by bioinformatics. Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect and analyze different pig breeds. The expression level of SLC13A5 and Wnt10b gene mRNA in different tissues. SNPs were found in the amplified target fragment by PCR-RFLP method, and then the porcine samples were typed. The gene frequency and genotype frequency were calculated, and then the genotype was correlated with the corrected age of 100kg and the corrected backfat thickness. [Conclusion: the cDNA of SLC13A5 gene obtained from large white pig is 2118bp, containing a 1665bp ORF. 5r-UTR557bp and 3H-UTR1320bp, encoding 554 amino acids; The phylogenetic tree of porcine SLC13A5 gene and other species showed that pig and domestic sheep had the closest homology, followed by macaques, and furthest from Xenopus laevis, pigeon and tit. Amino acid sequence analysis showed that the protein was fat-soluble, the relative molecular weight was 61183.7 Daand the theoretical isoelectric point Pi was 7.45; Eighteen potential glycosylation sites were predicted, including 8 transmembrane domains. The secondary structure is mainly irregular crimp, and the tertiary structure is curved spiral structure. Fluorescence quantitative PCR analysis showed that the expression of SLC13A5 gene in the same tissue was different in 25-day-old white pigs and Shailing pigs. The difference of the gene in cecum and longissimus dorsi muscle was very significant in different varieties, and in liver and leg muscle, the difference was significant in different tissues (P0.05). There was significant difference between the longissimus dorsi and the other 9 tissues in the same variety (P0.05). The mutation point was found on the amplified target fragment by PCR-RFLP analysis. The mutation point was located at A251G, then genotyped the sample, the result showed that AA. There was no significant difference in corrected age and backfat thickness between AG and GG genotypes. The total cDNA length of porcine Wnt10b gene was 2075 BP, including the coding region of 1170 BP. The deduced amino acid sequence of pig Wnt10b was more than 94% with that of human, chimpanzee, mouse, norvegicus, horse, cattle and macaque. WntlOb gene was conserved in animal evolution. Amino acid sequence analysis showed that the protein encoded by this gene has a relative molecular weight of 42873.2 Daa and a theoretical isoelectric point Pi of 9.46, which is a water-soluble protein. The prediction contains 20 phosphorylation sites and a WNT1 domain in the secondary structure of the protein. It is predicted that the Wnt10b protein plays an important role in fat metabolism and protein translocation. The results of fluorescence quantitative analysis showed that the difference of Wnt10b gene in P0. 0042) between big white pig and Shailing pig was very significant (P 0. 01). There was a significant difference in the expression of WNT10B gene between the two pig species. There was no significant difference in other tissues (kidney, heart, liver, lung, leg muscle). The genotyping of the samples by PCR-RFLP showed that there was no significant difference in the corrected age and backfat thickness between the two genotypes (P 0.05). [Conclusion this study provides a theoretical basis for further study on the mechanism of SLC13A5 and WntlOb genes in fat deposition and fatty acid metabolism.
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S828

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