牦牛源御成门沙门氏菌对小鼠的致病性研究

发布时间：2018-01-24 09:17

本文关键词： 牦牛沙门氏菌毒力致病性御成门沙门氏菌细菌的动态分布组织病理学细胞因子　出处：《西南民族大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：牦牛是青藏高原特定环境下形成的特有物种,是当地牧民重要的生活和生产资料。沙门氏菌能够感染人类和多种动物,是重要的食源性致病菌,也是牦牛常见病原菌之一。沙门氏菌血清型众多,不同血清型沙门氏菌致病力差别很大,对宿主的危害程度不同。因此,对牦牛源沙门氏菌致病性的研究,对牦牛沙门氏菌病的防控和公共卫生学都具有重要意义。本实验室前期从健康牦牛粪便中分离得到31株沙门氏菌,属于8种血清型,分别为御成门沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、布利丹沙门氏菌、斯坦利沙门氏菌、奥雷翁沙门氏菌和纽波特沙门氏菌,其中优势血清型沙门氏菌为肠炎沙门氏菌、都柏林沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌,但未对其致病性进行研究。本研究的目的是确定这8种血清型沙门氏菌对小鼠的致病性,并对御成门沙门氏菌在感染小鼠体内的动态分布、引起的组织病理学变化和所引起的免疫应答等方面进行研究,其主要研究内容和成果如下:1测定了8株不同血清型牦牛源沙门氏菌的毒力不同血清型沙门氏菌致病力差别很大,而牦牛源沙门氏菌的相关研究报道甚少,本研究随机选择本实验室保存的8个血清型牦牛源沙门氏菌各1株,以SPF级BALB/c雌性成年小鼠为实验动物,通过直接灌胃的方法接种细菌,测定其半数致死量(LD50)。结果显示:御成门沙门氏菌、布利丹沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、纽波特沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和斯坦利沙门氏菌等7株沙门氏菌的LD50分别为5×102、1.8×102、2.2×103、5.1×103、1.3×104、6.1×105和1.7×105 CFU,而奥雷翁沙门氏菌不致死小鼠,灌胃接种2.7×108CFU/只后,小鼠仅有2/5个体出现精神沉郁、被毛逆立等一过性症状。从实验结果可见:除奥雷翁沙门氏菌外,7株菌的毒力普遍很强,其中御成门沙门氏菌和布利丹沙门氏菌的毒力超强,仅数百个CFU经胃肠道途径感染即可致死未经抗生素预处理的成年小鼠,其致病机制值得进一步探讨。2建立了御成门沙门氏菌感染小鼠的模型沙门氏菌的感染模型对研究其感染与免疫机理、药物及疫苗研发等具有重要意义,链霉素预处理的小鼠模型是最常用的,但该模型不能用于研究沙门氏菌如何突破肠道菌群的抵抗。本研究根据御成门沙门氏菌毒力测定结果,以5×105cfu/只剂量给未经抗生素处理的spf级balb/c雌性成年小鼠经灌胃方式接种御成门沙门氏菌,建立感染模型,先后进行5次独立的重复感染试验。结果显示:御成门沙门氏菌感染小鼠的潜伏期为2~3d,病鼠主要出现精神沉郁、食欲减退、畏寒扎堆等症状,3~4d开始出现死亡,10d内感染小鼠全部死亡。剖检可见小鼠肝脏有弥漫性出血点,脾脏密布有大小不一的灰白色坏死灶,小肠内充满淡黄色浆液性内容物。5次重复感染试验均得到相似的结果。从研究结果可见:本研究成功地建立了御成门沙门氏菌对未经抗生素处理的balb/c小鼠感染模型,稳定可靠,可复制性强。该模型在研究沙门氏菌突破肠道防御屏障的机制等方面具有显著的优势,为沙门氏菌感染与致病机制的研究提供了有价值的新模型。3研究了御成门沙门氏菌在感染小鼠体内的动态分布病原菌定植、内化、增殖及在体内扩散蔓延规律是致病机制研究的重要内容。御成门沙门氏菌最早是从日本健康女性体内分离到,随后在日本、土耳其、墨西哥、以色列、德国以及中国等国家均有对该菌的研究报道,但关于该菌在体内的增殖情况还未见报道。本研究以御成门沙门氏菌的小鼠感染模型为基础,旨在研究其在感染小鼠体内的增殖及动态分布情况。以5×105cfu/只剂量御成门沙门氏菌感染小鼠,分别于感染后24h、48h、72h、96h、5d、6d和7d等不同时间点随机抽取3只实验组小鼠和3只对照组小鼠,无菌采集小鼠脑组织、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及胰腺等,将组织称重后匀浆,采用平板菌落计数法测定不同组织器官中细菌的荷载量。结果显示:能从所有被检组织器官中检出御成门沙门氏菌,但不同组织检出时间不同。在感染后24、48h只能从肺脏中分离到细菌,肝脏、脾脏、肾脏及胰腺在感染后72h分离出细菌,而心脏和脑组织则在感染后96h才回收到该菌。该菌在各组织器官中的荷载量随着病程的发展持续增加,第7天的荷载量最高,但不同组织中细菌荷载量不同,其中脾脏中含量最高[(1.3±0.5)×108cfu/g],其次为肺脏[(4.4±1.3)×107cfu/g]和肝脏[(3.2±0.9)×107cfu/g],脑组织中含量最低[(6.8±1.2)×105cfu/g]。从结果可见:御成门沙门氏菌在突破肠道防御屏障后首先移行到肺脏并在其中增殖,以后再移行到脾脏、肝脏等其他实质器官。其中肺脏、脾脏和肝脏是御成门沙门氏菌主要的增殖场所,这与肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的主要增殖部位为脾脏和肝脏有所不同。关于御成门沙门氏菌的感染机制特别是其突破肠道防御屏障后首先侵染肺脏的机制有待进一步研究。4研究了御成门沙门氏菌感染小鼠引起的病理组织学变化本研究旨在了解御成门沙门氏菌感染小鼠引起的病理组织学变化,观察御成门沙门氏菌对小鼠的致病特征。以5×105cfu/只剂量御成门沙门氏菌感染小鼠,按照病理组织学采样要求采集“御成门沙门氏菌在感染小鼠体内的动态分布”试验中各时间点小鼠的组织样本,除采集脑组织、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及胰腺外,还采集十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠等组织,福尔马林固定、切片、he染色,观察其病理组织学变化。结果显示:御成门沙门氏菌感染后,小鼠肺脏、心脏、肝脏、脾脏和肾脏等实质器官中出现巨噬细胞和淋巴细胞增生、侵润病灶,组织细胞变性及凝固性坏死等病理变化,且病变随着病程而逐渐加重,胰腺和脑组织中未见明显的病理变化。有趣的是经胃肠道途径感染小鼠仅在其回肠段观察到固有层出现少量巨噬细胞、嗜中性粒细胞与淋巴细胞侵润,且随着病程的发展,出现肠绒毛上皮细胞脱落,肠上皮与固有层细胞出现凝固性坏死,而其他肠段未见明显病理变化。由上述研究结果可见:御成门沙门氏菌能引起小鼠主要内脏器官的广泛性病理组织学损伤,而回肠段的病理组织学变化则提示御成门沙门氏菌可能是从这一部位突破肠道防御屏障进入其他组织器官的。这与已报道的沙门氏菌通过结肠、盲肠等途径入侵深层组织有所不同。御成门沙门氏菌入侵深层组织并在体内扩散蔓延的机制有待深入研究。5研究了御成门沙门氏菌感染对小鼠5种细胞因子的影响tnf-α、ifn-γ、il-1β、il-4和il-6等细胞因子与沙门氏菌的感染和病理损伤程度密切相关,本实验旨在研究御成门沙门氏菌感染对上述5种细胞因子的影响。按照御成门沙门氏菌的小鼠感染模型建立的方法感染小鼠18只,分别在感染后24h、48h和72h选取实验组3只和对照组3只小鼠,采取小鼠的肺脏、肝脏、脾脏、心脏、空肠、回肠和结肠,采用荧光定量PCR方法,检测感染后5种细胞因子的m RNA在上述组织器官中的相对表达量,用小鼠β-actin内参基因进行标化处理。结果显示:感染后24h,在肺脏中,五种细胞因子的mRNA的相对表达量均受到显著抑制;在脾脏和肝脏中,除TNF-α外,IFN-γ、IL-1β、IL-4和IL-6的mRNA的相对表达量均受到显著抑制;而在心脏中,TNF-α、IL-4和IL-6的mRNA的相对表达量均显著升高,IL-1β受到显著抑制,而IFN-γ与对照组相比,变化不大。在感染后72h,五种细胞因子的m RNA的相对表达量均急剧升高。在肠组织中,IFN-γ、IL-4和IL-6的mRNA的相对表达量呈现先升高后降低的趋势。感染后24h,表达量急剧升高,而在感染后72h表达量降低,受到抑制;IL-1β除在回肠中感染后24h表达量显著升高,在检测的肠组织中均受到抑制;而TNF-α在回肠中随感染时间的延长,表达量显著升高,在空肠和结肠中表现出先升高后降低的趋势。本实验结果表明:在感染早期,御成门沙门氏菌感染显著抑制小鼠体内IFN-γ、IL-1β、IL-4和IL-6在肺脏、脾脏和肝脏中的表达,从而有利于细菌的增殖;随感染时间的延长,上述五种细胞因子在小鼠体内实质器官中的表达量急剧升高,导致机体病理损害程度的加重。
[Abstract]:The results of this study are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . The LD50 of Salmonella typhimurium is 5 脳 102 , 1.8 脳 102 , 2.2 脳 103 , 5.1 脳 103 , 1.3 脳 104 , 6.1 脳 105 and 1.7 respectively . In order to study the mechanism of Salmonella typhimurium infection in mice infected with Salmonella typhimurium , the results showed that the mice infected with Salmonella typhimurium were isolated from healthy female mice at 5 脳 105cfu / dose . IL - 1尾 , IL - 1尾 , IL - 4 and IL - 6 mRNA were significantly inhibited in the spleen and liver , and the relative expression of IL - 1尾 , IL - 4 and IL - 6 increased significantly after infection .

【学位授予单位】：西南民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.23

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