褪黑素通过刺激支持细胞分泌GDNF促进奶山羊精原干细胞的增殖

发布时间：2018-01-28 23:24

  本文关键词： 褪黑素 精原干细胞 支持细胞 GDNF 繁殖季节 奶山羊　出处：《西北农林科技大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：褪黑素是动物松果体分泌的一种吲哚类激素,其分泌受光照的调节,光照时间长,强度高,分泌多;光照时间短,强度低,分泌少。在我国北方地区,每年的秋冬季节为奶山羊的繁殖季节,褪黑素的分泌量大,雄性山羊的精液品质高。在本实验中,我们采集了繁殖与非繁殖季节成年奶山羊的睾丸组织,组织切片HE染色发现,繁殖季节奶山羊精子发生更加活跃,各级生精细胞数目较多,自我更新和增殖相关标记基因的表达水平较高。免疫组织化学染色发现,在精子发生的各级生精细胞中均存在褪黑素的受体,在繁殖季节其受体的表达水平高。这些结果表明雄性奶山羊存在季节性繁殖现象,且褪黑素可能参与引起季节性繁殖现象。研究认为,动物的繁殖行为主要是依靠下丘脑-垂体-性腺轴调控,而褪黑素在其中发挥重要作用,褪黑素可以直接或间接作用于下丘脑,垂体以及生殖细胞来调节相关激素的分泌以及精子发生和卵子发生。精原干细胞是存在于曲细精管基底膜的一类具有自我更新和分化为精子能力的细胞,是精子发生过程中的“起始细胞”,为了研究褪黑素是否通过精原干细胞来调节精子发生进而参与季节性繁殖的形成,本实验在体外培养奶山羊精原干细胞,并用褪黑素予以干预,得到以下结果:1.采用Ⅳ型胶原酶和胰蛋白酶结合消化法分离奶山羊睾丸组织细胞,经过差速贴壁法富集,利用奶山羊精原干细胞培养液进行体外培养获得奶山羊精原干细胞克隆,克隆呈CD49f、GFRa1、PGP9.5阳性,碱性磷酸酶弱阳性,同时在mRNA和蛋白水平表达精原干细胞标记PLZF,说明培养体系适用于奶山羊精原干细胞的培养。2.通过对细胞活力和增殖相关标记检测以及细胞克隆大小判断,发现褪黑素可以促进奶山羊精原干细胞的增殖。对支持细胞标记检测发现,褪黑素也可以促进支持细胞的标记SOX9和GDNF的表达,对精原干细胞分化标记基因Stra8,Dazl、Kit和Sycp3检测发现,褪黑素抑制精原干细胞的分化。而利用CCK-8,MTT以及Brdu染色发现,褪黑素对mGSCs-I-SB细胞的增殖没有影响。3.Elisa检测发现,在体外培养奶山羊精原干细胞时,支持细胞可以产生GDNF来维持精原干细胞的增殖和自我更新。加入褪黑素以后,上清液中的GDNF含量明显升高,这说明褪黑素可以刺激支持细胞产生GDNF,继而促进奶山羊精原干细胞的增殖和自我更新。Western blotting实验发现,GDNF是通过激活AKT和ERK1/2的磷酸化水平进行增殖和自我更新,且以p-ERK1/2的激活为主,加入褪黑素以后磷酸化的水平更高,这进一步说明褪黑素是通过GDNF这条通路促进山羊精原干细胞的增殖。通过体外褪黑素对奶山羊精原干细胞的影响实验,我们认为繁殖季节奶山羊体内褪黑素生成较多,可以刺激支持细胞产生更多的GDNF,进而促进奶山羊精原干细胞的增殖和自我更新,以维持精原干细胞池的稳定。精子发生的调节还有其他多种激素的参与,在它们共同作用下形成了短日照动物的季节性繁殖现象。
[Abstract]:In the northern part of China , it is found that melatonin may play an important role in the reproduction season of dairy goats , and melatonin may play an important role in the reproduction season . It was found that melatonin could stimulate the proliferation and self - renewal of spermatogonial stem cells in milk goat . After addition of melatonin , it was found that melatonin could stimulate the proliferation and self - renewal of spermatogonial stem cells .

【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S827

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本文编号：1471840