谷胱甘肽过氧化物酶5在内蒙古绒山羊附睾的表达与调控

发布时间：2018-02-04 23:31

  本文关键词： 附睾 活性氧 GPx5 细胞培养 附睾上皮细胞 雄激素 氢化可的松 细胞增殖 雄激素受体　出处：《内蒙古农业大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：附睾是精子成熟的主要场所,对其功能功能调节机理的详细研究,在提高雄性繁殖能力等方面有重要的理论指导意义。谷胱甘肽过氧化物酶5(Glutathione Peroxidase 5,GPx5)作为具有抗氧化作用的附睾特异表达蛋白,在精子抗氧化保护及附睾微环境稳定维持中发挥着重要作用。国内外尚没有GPx5在山羊附睾的详细研究,本研究以内蒙古绒山羊为研究对象,检测了初情期、体成熟期和老龄期3个生殖生理阶段睾丸和附睾不同部位GPx5的表达规律,首次建立了纯度高、稳定性好的绒山羊附睾上皮细胞培养体系,并探讨了甾体类激素对绒山羊附睾上皮细胞增殖的影响及GPx5表达调节的可能机制。研究结果如下:1.采用荧光定量PCR、免疫印迹和免疫组化法检测了初情期、体成熟期和老龄期绒山羊睾丸和附睾各部GPx5 mRNA和蛋白表达量。结果显示各生殖生理阶段绒山羊睾丸中均未见GPx5表达,附睾中均有GPx5表达。各生殖生理阶段附睾表达区域及表达量存在差异:初情期,GPx5 mRNA和蛋白主要表达于附睾头部;体成熟期,附睾各区域GPx5 mRNA和蛋白的表达量极显著高于其他阶段,附睾起始部和附睾头部为主要表达区;老龄期,GPx5 mRNA和蛋白主要表达于附睾头部,但较体成熟期明显减少。免疫组化定位显示GPx5蛋白主要分布于附睾上皮细胞,而且各年龄阶段绒山羊附睾腔内精子上都有明显的GPx5阳性信号。研究表明绒山羊附睾GPx5的表达区域及表达量变化与动物生殖生理阶段直接相关。2.10-12月龄绒山羊附睾起始部及头部分别采用酶消化法和改良组织块消化法进行原代培养,利用免疫细胞化学染色法和免疫荧光化学法对细胞进行鉴定,同时利用流式细胞仪和Cell Counting Kit(CCK)法分别检测了细胞纯度和增殖情况,并在电镜下观察细胞超微结构。结果表明,两种培养方法所获细胞均呈岛屿状克隆生长,均有较好的增殖能力,并具有活跃的分泌和代谢功能;上皮细胞特异性角蛋白18(Cytokeratin 18,CK18)和GPx5的表达以及流式细胞仪结果显示,两种方法所获细胞均为纯度较高的附睾上皮细胞,但改良组织块消化法获得原代细胞需要的时间长,相比而言,酶消化法获得原代细胞时间短,获得的细胞量大。这为进一步研究绒山羊上皮提供了良好基础。3.采用CCK法检测睾酮、氢化可的松对细胞增殖的影响,细胞免疫化学法对体外培养附睾上皮细胞雄激素受体(Androgen Receptor,AR)定位,荧光定量PCR、ELISA法检测AR mRNA和蛋白表达量。结果显示,与对照组相比,低浓度睾酮(以100nmol.L-1为主)对附睾上皮细胞增殖有明显促进作用,而高浓度睾酮(1000 nmol.L-1)对细胞增殖无显著促进效应,表明睾酮对附睾上皮细胞增殖有促进作用,且具有剂量依赖性。200 nmol.L-1 氢化可的松对附睾上皮细胞也有促增殖作用。当200 nmol.L-1氢化可的松与100 nmol.L-1睾酮同时存在时对细胞增殖表现有协同作用。100 nmol.L-1睾酮与200 nmol.L-1氢化可的松均可上调附睾上皮细胞AR mRNA和蛋白表达量,二者共存时AR mRNA和蛋白表达量极显著提高。另外,AR免疫细胞化学定位结果显示,附睾上皮细胞有AR蛋白表达,且表达模式与组织内表达相似。4.利用流式细胞技术检测了外源性睾酮对附睾上皮细胞内ROS(Reactive Oxygen Species)的影响,荧光定量PCR和ELISA法分别检测了外源性睾酮对附睾上皮细胞内GPx6和ARmRNA和蛋白表达量的影响。结果表明,低浓度睾酮能够降低细胞内ROS水平,高浓度睾酮(1000 nmol.L-1)则无此效应;100 nmol.L-1睾酮使GPx5表达量显著提高,该效应可以被AR受体阻断剂阻断,高浓度睾酮对GPx5表达量较对照组无显著性差异;100 nmol.L-1睾酮使AR表达量显著上调,高浓度睾酮使AR表达量较对照组显著下调。表明,外源性低浓度睾酮可以上调AR数量进而提高附睾上皮细胞GPx5的表达量,能够降低细胞内ROS水平而对附睾上皮细胞起保护作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S827

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本文编号：1491466