鸭坦布苏病毒XZ-2012株的分离鉴定及囊膜蛋白抗原表位的鉴定

发布时间：2018-02-09 16:15

  本文关键词： 鸭坦布苏病毒 分离鉴定 单克隆抗体 抗原表位　出处：《南京农业大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：鸭坦布苏病毒病(duck Tembusu virus disease)是于2010年在我国新出现的一种以采食、产蛋下降和瘫痪为特征的禽类传染病,其病原为鸭坦布苏病毒(duck Tembusu vius,DTMUV)。DTMUV主要危害鸭和鹅,也有鸡群感染发病的报道,不同来源的DTMUV分离病毒株的基因同源性均高于98%。该病在蚊虫活跃季节发病率高,但冬季也有发病,因此传播途径不限于蚊媒。鸭坦布苏病毒为黄病毒科、黄病毒属、恩塔亚病毒群中的坦布苏病毒(Tembusu virus)。病毒的基因组为正股单链RNA,长约11 knt,基因组结构为5'UTR-C-prM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3'UTR。囊膜蛋白(E)是DTMUV主要的表面结构蛋白,参与病毒与宿主细胞受体的结合,含有病毒的主要中和抗原表位。DTMUVNS1蛋白参与病毒的组装,也可以二聚体或六聚体的形式分泌至胞外,拮抗宿主的先天性免疫。E蛋白和NS1蛋白为DTMUV的2个最主要免疫保护性抗原,关于其抗原表位信息报道较少。本研究分离鉴定了一株鸭源坦布苏病毒,研究其生物学特性,测定其全基因序列,分析其基因进化特征。应用细胞融合技术制备了 4株抗DTMUV E蛋白和NS1蛋白的单克隆抗体,其中针对E蛋白的单克隆抗体能区分DTMUV和日本脑炎病毒(JEV)抗原,DTMUV囊膜蛋白特异抗原表位的发现为DTMUV血清学诊断方法的建立奠定基础。具体研究如下:1鸭坦布苏病毒XZ-2012株的分离鉴定与基因变异分析2012年10月徐州地区某鸭场爆发了樱桃谷种鸭产蛋骤然下降的疫病,患病鸭表现为发热、采食减少、产蛋下降,剖检可见脾肿大、卵泡出血、萎缩等。本研究从送检病料中分离到一株鸭坦布苏病毒,命名为DTMUV XZ-2012株。DTMUV XZ-2012株能适应鸡胚培养,于BHK-21细胞上第5代的病毒滴度为5×104 PFU/mL。应用RT-PCR的方法扩增DTMUV XZ-2012基因,测序发现其基因组全长为10990nt,编码的多聚蛋白有3426个氨基酸。DTMUV XZ-2012株与文献报道的BYD株、YY5株、JS_2010株等DTMUV的全基因同源性为98.5%-99.3%。与国内最初分离的DTMUV BYD株等相比,DTMUV XZ-2012的基因变异主要分布于E基因、NS1基因和NS2a基因,提示该病毒在自然界的流行存在一定的免疫压力。2鸭坦布苏病毒EDⅢ蛋白单克隆抗体的制备与特性鉴定用纯化的鸭坦布苏病毒重组EDⅢ蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体,共获得2株能稳定分泌抗鸭坦布苏病毒EDⅢ抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3C4和3D12。经间接ELISA测定,2株杂交瘤细胞培养上清效价均为1:12800。腹水效价分别为1×105和2×105。单克隆抗体亚类鉴定结果显示,3C4株单抗的亚类为IgG1κ型,3D12株单抗的亚类为IgG2bK型。间接免疫荧光试验与Westernblot鉴定结果表明3C4、3D12株杂交瘤细胞能特异性识别细胞中鸭坦布苏病毒的EDⅢ蛋白,与日本脑炎病毒没有交叉反应。中和试验显示这两株单抗没有中和活性。3鸭坦布苏病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备利用纯化的鸭坦布苏病毒NS1蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体,共获得2株能稳定分泌抗鸭坦布苏病毒NS1蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2F6和2F12。经间接ELISA测定,2株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1:6400、1:12800。腹水效价均为1:1×105。单克隆抗体亚类鉴定结果显示,2F6、2F12株单抗的亚类均为IgG1,2株单抗的轻链均为κ型。Western blot与间接免疫荧光试验鉴定结果表明2F6、2F12株杂交瘤细胞能特异性识别DTMUV接种细胞中的NS1蛋,2F12与日本脑炎病毒接种细胞有交叉反应,2F6与JEVNS1没有交叉反应。4鸭坦布苏病毒EDⅢ蛋白B细胞表位的鉴定为了对获得的2株抗鸭坦布苏病毒EDⅢ蛋白的单克隆抗体所针对的抗原表位进行精确定位,本研究通过原核表达了截短的EDⅢ蛋白,人工合成了多肽抗原。通过ELISA和Western blot方法精确定位了这两株单克隆抗体所识别的抗原表位。结果显示这两株囊膜蛋白单克隆抗体针对的是同一表位310SLVKNP315。经分析发现该表位高度保守,且与其他黄病毒不交叉。以上结果丰富了鸭坦布苏病毒EDⅢ蛋白抗原表位图谱,为EDⅢ蛋白相关功能的进一步研究和鸭坦布苏病毒鉴别诊断奠定了基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 贡树基;周浩;陈丽丹;梁冰锋;;登革2型病毒E基因克隆及B细胞抗原表位分析[J];白求恩军医学院学报;2007年06期

2 王艳华;张德林;殷宏;付宝权;;抗原表位预测方法的研究进展[J];中国兽医科学;2009年10期

3 肖治军;张改平;杨汉春;杨艳艳;赵东;李学伍;邓瑞广;柴书军;邢广旭;杨继飞;;传染性法氏囊病病毒VP2蛋白B细胞抗原表位免疫小鼠试验[J];华北农学报;2010年02期

4 王芳;刘晓丽;赵飞;韩宗玺;邵昱昊;孔宪刚;刘胜旺;;禽传染性支气管炎病毒单克隆抗体的制备及其B细胞抗原表位的鉴定[J];中国预防兽医学报;2012年04期

5 郭春艳;赵向绒;胡军;;B细胞抗原表位的研究进展及其应用[J];生物技术通讯;2013年02期

6 吴玉章,朱锡华;研究蛋白质抗原表位的方法学评述[J];国外医学(免疫学分册);1991年05期

7 郭茉;徐黎明;周兵;尹杰超;任桂萍;李德山;;基于细菌展示技术的高通量抗原表位筛选方法的建立[J];中国免疫学杂志;2014年03期

8 汪源;梁久红;董晨;田华;戴星;赵宇;孟继鸿;;戊型肝炎病毒第Ⅳ基因型特异性抗原表位的鉴定与定位[J];微生物与感染;2006年03期

9 周艳君;田志军;刘金霞;安同庆;彭金美;薛强;蔡雪辉;于海;李国新;刘娣;童光志;王云峰;王玫;;猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白B细胞抗原表位的鉴定[J];中国预防兽医学报;2009年04期

10 李玉;李功勇;黄军龙;;鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白B细胞抗原表位预测[J];广东畜牧兽医科技;2010年02期

相关会议论文 前10条

1 王进荣;杨利国;;人卵泡抑制素α亚基抗原表位的预测[A];第四届中国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集[C];2001年

2 孙长江;韩文瑜;;抗原表位的研究与应用进展[A];2006中国微生物学会第九次全国会员代表大会暨学术年会论文摘要集[C];2006年

3 赵钦;孙亚妮;赵冀楠;王鑫杰;周恩民;;禽戊型肝炎病毒衣壳蛋白的抗原表位分析[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年

4 李明;王文敬;;传染性病原体抗原表位组学的应用研究[A];全国寄生虫学与热带医学学术研讨会论文集[C];2006年

5 安同庆;周艳君;仇华吉;王云峰;童光志;;利用噬菌体展示技术鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原表位[A];中国生物化学与分子生物学会农业生物化学与分子生物学分会第六次学术交流会论文集[C];2004年

6 胡晓林;;B细胞抗原表位研究进展[A];天津市核学会2005年学术交流会论文汇编[C];2005年

7 赵钦;周恩民;董施伟;;禽戊型肝炎病毒衣壳蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会论文集[C];2010年

8 郑佳琳;江飙;张东霞;施赫赫;郭霄峰;;狂犬病病毒糖蛋白抗原表位富集区单克隆抗体的制备[A];中国畜牧兽医学会生物制品学分会中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2010年学术年会（第三届中国兽药大会学术论坛）论文集[C];2010年

9 郑佳琳;江飙;张东霞;施赫赫;郭霄峰;;狂犬病病毒糖蛋白抗原表位富集区单克隆抗体的制备[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第二次学术研讨会论文集[C];2010年

10 庞耀珊;谢芝勋;谢丽基;邓显文;谢志勤;刘加波;谢体三;;H5N1亚型AIV HA抗原表位的高效表达及其抗原活性分析[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次人兽共患病学术研讨会暨第六届第十四次教学专业委员会论文集[C];2012年

相关博士学位论文 前10条

1 王玉娥;猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白抗原表位的分析[D];中国农业大学;2003年

2 周艳君;猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定[D];东北农业大学;2005年

3 何小鹃;人类γδT细胞抗原表位肽的鉴定和健康人γδT细胞克隆的建立及鉴定[D];中国协和医科大学;2008年

4 张嘉杰;SARS冠状病毒S蛋白抗原表位多肽的设计、合成及其免疫反应[D];第一军医大学;2004年

5 张文红;抗原表位肽的快速筛选鉴定及其在免疫检测和抗体制备中的应用[D];第四军医大学;2005年

6 肖昌;亨得拉和尼帕病毒结构蛋白的表达及抗原表位研究[D];吉林大学;2006年

7 彭梅;重组丙型肝炎病毒结构蛋白抗原表位的表达及免疫原性[D];中国协和医科大学;2001年

8 辛忠涛;应用细菌表面展示技术快速筛选抗原表位及研制应急疫苗[D];中国人民解放军军事医学科学院;2003年

9 王本旭;人巨细胞病毒M抗原表位的筛选与初步应用研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2007年

10 刘海灿;结核分枝杆菌八种蛋白抗原中人T/B细胞抗原表位多态性研究[D];中国疾病预防控制中心;2014年

相关硕士学位论文 前10条

1 张沁;蓝舌病病毒15型VP2、NS3蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定[D];中国农业科学院;2015年

2 任建乐;牛副流感病毒3型NP蛋白单抗制备及其抗原表位鉴定与双抗夹心ELISA建立[D];中国农业科学院;2015年

3 孔德生;不同亚型兔出血症病毒单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定[D];中国农业科学院;2015年

4 赵鑫;模拟消化对Pen a1及其抗原表位免疫原性的影响[D];中国农业科学院;2015年

5 王海秀;蓝舌病病毒12型NS1蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定[D];中国农业科学院;2015年

6 王康;猪流行性腹泻病毒流行毒FJzz1/2011株对仔猪的致病性分析及N蛋白抗原表位的鉴定[D];中国农业科学院;2015年

7 周跃辉;牛传染性鼻气管炎病毒糖蛋白gD单抗制备及其抗原表位鉴定与双抗夹心ELISA的建立[D];中国农业科学院;2015年

8 夏文跃;轮状病毒VP4抗原表位在VP6载体蛋白同一位点表达比较研究[D];北京协和医学院;2015年

9 杨阳;拟穴青蟹过敏原精氨酸激酶的抗原表位分析研究[D];集美大学;2015年

10 袁庆;猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白单克隆抗体制备与抗原表位筛选[D];东北农业大学;2015年

，

本文编号：1498338