禽致病性大肠杆菌ArcA基因的缺失及其致病机理的研究

发布时间：2018-02-24 07:24

  本文关键词： 禽致病性大肠杆菌(APEC) arcA基因 趋化性 运动性和毒力调节 缺失株 转录组　出处：《南京农业大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：禽致病性大肠杆菌(AvianPathogenic E.coli,APEC)是引起养禽业最严重的三种感染性疾病之一,同时它也是一种威胁人类健康的潜在食源性致病菌。本研究所用的XM(02:K1)菌株属于大肠杆菌系统进化树中的B2群,是从有败血症和神经症状的病鸭大脑中分离出的致病菌株。已有研究发现这一菌株可以引起乳鼠严重的脑膜炎症状。尽管大肠杆菌的致病机理已经得到了广泛的研究,越来越多的研究发现,除了已知的经典致病因子以外,仍然存在很多潜在的致病因子。本研究中,我们选择二元调控系统ArcB-ArcA中的ArcA基因进行研究,ArcB-ArcA二元调控系统是一种主要调控细菌适应环境中氧浓度的信号转导系统,该酶促防御系统可以促进细菌从有氧到厌氧状态下新陈代谢的转换,并且可以激活细菌对抗活性氧(ROS)。本研究首次发现ArcA还具有调节APEC XM的毒力的作用,因此,对ArcA参与调节APEC XM的毒力的作用机制进行了探索。利用RED同源重组技术构建了 APEC XM的arcA基因缺失株,并利用低拷贝质粒pGEN-MCS构建了 arcA基因的互补株,同时将pGEN-MCS质粒导入arcA基因缺失株中,构建了对照株。通过比较野生株、缺失株、互补株的生长速度以及致病力,分析aarcA对APEC XM的致病力作用。结果显示,缺失株的生长速度稍慢于野生株和互补株,但差异不显著。雏鸭半数致死量LD50测定的结果显示,野生株的LD50为 3.43×104 CFU,缺失株的 LD50 为 1.49×106 CFU,互补株的 LD50 为 6.37×104 CFU。表明缺失株的毒力显著下降,而互补株的毒力明显恢复。提示突变株毒力降低是真正由arcA基因缺失引起的。尽管试验结果表明arcA确实参与了 APEC XM的毒力调控,但是其毒力相关的机理仍然不清楚,因此对arcA缺失株和野生株XM分别在不同培养条件下进行转录组测序,以期找到arcA所调控的毒力相关基因。将野生株与缺失株分别在7日龄雏鸭血清和LB中微需氧条件下培养,提取两株菌的RNA,每组3个重复,进行转录组测序分析。arcA基因缺失株与野生株XM的转录组比较结果显示,在血清中,缺失株与野生株相比,p≤0.05,q≤0.1时,有129个基因表达量差异在2倍以上,为了验证RNA-Seq结果的准确性,我们筛选出grxA、flgB、flgK、fliC、fliD、oppB、oppD、yneI、Ildr、glc这10个基因进行荧光定量PCR验证,结果显示yneI、Ildr、glcF在缺失株中表达量显著上调,其余7个基因在缺失株中表达量显著下调,这与转录组测序分析的结果是一致的,并且所有基因荧光定量PCR的表达差异倍数均比转录组测序结果大。结果表明arcA对这些基因确实具有调节作用,同时也证实RNA-Seq的结果的真实可靠性。从转录组的分析结果中,在129个差异表达基因中并没有发现经典毒力因子,因此我们筛选出部分可能与大肠杆菌的致病性相关的基因,包括具有谷氨酸调控代谢功能的基因glnL、glnG,鞭毛合成功能的基因flgB、flgK、fliC、fliD、motD、motB,趋化性功能的基因cheA、cheW,柠檬酸代谢调控功能的基因citE:、citF、citC等,用荧光定量PCR进行验证,结果显示,这些基因在arcA缺失株中的表达水平与野生株中的存在显著差异,且变化趋势与转录组测序结果一致,表明arcA对这些基因确实具有调控作用,因此对这些基因进行进一步的研究,以期找到毒力相关基因。本研究利用RED同源重组技术,构建了 cheA、cheAW、motAW、flgBCDEFGHIJK、fliCD、citCEFXG、glnLG基因的缺失株,以7日龄健康雏鸭作为动物模型,选取1×107CFU,1×106CFU,1×1O5CFU三个不同剂量,每10只鸭子为一组,对野生株以及7个缺失株的毒力进行测定。腹腔注射感染后连续观察10天,记录鸭子死亡情况,并用fisher法统计差异显著性。结果显示,在攻毒剂量为1×105CFU时,cheA和motAB基因缺失株组的死亡数均为3,野生株组死亡数为8(p0.05),差异显著,而flgBCDEFGHIJK、fliCD、citCEFXG、glnLG、cheAW缺失株与野生株的毒力差异均不显著。进一步的研究表明cheA、cheAW、motAB基因的缺失对APEC的体外生长并不产生显著的影响。这些结果提示ArcA通过对cheA、motA、motB等趋化性以及运动性相关基因的调控,从而参与对APEC致病性的调控。据我们所知,这是关于ArcA基因致病性作用研究的首次报道。
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【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61

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本文编号：1529372