携带遗传标记的猪圆环病毒2型贵州分离株感染性克隆的构建

发布时间：2018-02-26 15:22

  本文关键词： 猪圆环病毒2型 生物信息学 遗传标记 感染性克隆 iDNA疫苗　出处：《贵州大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是无囊膜单股环状负链DNA病毒,基因组大小约为1.8kb,属于圆环病毒科,圆环病毒属。PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原体,可以引起猪圆环病毒相关疾病(PCVAD),其主要症状表现为皮肤苍白、消瘦、腹泻、呼吸障碍、黄疸等症状,发病猪群死亡率高和繁殖障碍等,给养猪业带来了巨大的经济损失。疫苗免疫接种是防控PCV2感染的有效手段,有关PCV2疫苗的研究已成为国内外学者的关注热点。由于近些年来提出的i DNA疫苗具有多项传统疫苗无法比拟的优点,该类疫苗为应用感染性克隆技术构建的新型核酸疫苗,在机体内能够发挥弱毒疫苗和核酸疫苗的双重免疫效果,具有较好的研发前景。本研究应用i DNA疫苗技术构建了一种携带遗传标记的PCV2新型感染性克隆,并对其免疫效果进行了初步研究,初步验证了PCV2 iDNA新型标记疫苗构建策略的正确性,为研究开发PCV2 iDNA标记疫苗奠定了前期基础。主要研究内容如下:1、猪圆环病毒2型GZ-RH1株全基因组遗传特征分析为掌握PCV2 Cap蛋白末端具有赖氨酸延伸特征的GZ-RH1株(JQ809464)的全基因组遗传特征和后续研究提供科学参考,应用生物信息学的方法和工具对其基因的结构和功能、编码蛋白的二级和三级结构、分子系统进化关系以及密码子偏好性等进行了预测和分析。全基因组核苷酸序列分析表明该毒株与先前报道的含有11个ORF框的PCV2毒株(AF027217)相比,ORF8和ORF11缺失,ORF5和ORF10终止密码子提前,其它ORFs则相对较为保守。推导蛋白的预测结果表明:PCV2 GZ-RH1各编码蛋白中除ORF4和ORF9外,其它蛋白均是亲水性蛋白,且仅ORF9编码的蛋白存在信号肽序列;ORF1和ORF2编码蛋白的潜在磷酸化位点与疫苗毒株相比,ORF1较为保守,ORF2则差异较大。编码主要蛋白的二级结构显示,均为混合型蛋白;ORF1、2、3编码蛋白的结构域和功能基序分析显示,除都具有自身蛋白家族的保守结构域外,还预测到一些可能具有特殊功能的结构域,如ORF1编码蛋白的NACHT结构域ORF2编码蛋白的精氨酸富集区;ORF2编码蛋白的三级结构预测结果显示,其和疫苗毒株结构具有较高的相似性。系统进化分析显示,PCV2 GZ-RH1毒株属于PCV2b亚型。ORF2编码蛋白氨基酸位点熵值结果显示,氨基酸变异较大,且含有两个高变区,分别位于第53~91位和185~215位。ORF2基因密码子偏爱性分析显示,昆虫细胞与其密码子偏爱性较为接近,更适合其体外表达。2、携带遗传标记的PCV2感染性克隆的构建及iDNA疫苗的初步研究为构建获得携带遗传标记的猪圆环病毒2型感染性克隆质粒(iDNA),并对其进行PCV2 iDNA疫苗的初步研究,实验以Cap蛋白末端具有赖氨酸延伸特征的PCV2 GZ-RH1株为材料,构建了该毒株的感染性克隆质粒pcDNA3.1(+)-PCV2,并在病毒基因组中引入一个SalⅠ酶切位点作为鉴别拯救病毒的遗传标记。将该感染性克隆质粒转染PK-15传代细胞后,拯救获得的PCV2标记毒株,经盲传10代后毒价可到105.3TCID50/mL,引入的遗传标记能够稳定存在。为进一步评估该PCV2 i DNA候选标记疫苗在昆明小鼠体内的生物学特性,将20只小鼠随机分为4组,实验Ⅰ组肌肉注射100μg PCV2 iDNA候选标记疫苗(质粒pcDNA3.1(+)-PCV2),实验Ⅱ组肌肉注射0.1mL拯救病毒PCV2-RV(104TCID50/mL),实验III组肌肉注射100μg pcDNA3.1(+)空质粒阴性对照组,实验Ⅳ组肌肉注射0.1mL MEM营养液阴性对照组,而后分别于接种后7、14、21、28、35、42d小鼠断尾采血,检测PCV2特异性抗体水平和病毒血症持续时间。结果显示,接种PCV2 iDNA候选标记疫苗和其体外拯救病毒的小鼠特异性抗体水平明显高于对照组,接种后7d即可检测出PCV2阳性抗体且至少可维持42d;经PCR检测证实,PCV2 i DNA候选标记疫苗和其体外拯救病毒均能够在小鼠体内增殖,导致小鼠产生病毒血症的持续时间约28d。上述研究结果表明,本研究所提出的PCV2 iDNA新型标记疫苗的构建策略是可行的,并为进一步研究开发PCV2 i DNA新型标记疫苗奠定了基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 徐绍建;李俊;曹帅;时建立;周顺;徐文;张秀美;王金宝;;猪圆环病毒2型全序列分析及感染性克隆的构建[J];中国兽医杂志;2009年01期

2 王光祥;郑海学;尚佑军;刘艳红;常艳燕;田宏;吴锦艳;陈江涛;刘湘涛;;猪圆环病毒2型感染性克隆的构建[J];中国兽医科学;2009年11期

3 王明亮;刁有祥;纪巍;孔义波;高继明;;猪圆环病毒2型感染性克隆的构建[J];中国兽医学报;2011年03期

4 吕健;韦祖樟;高飞;郑海红;童光志;袁世山;;猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株嵌合感染性克隆的构建及鉴定[J];畜牧兽医学报;2012年10期

5 李祥健;张建武;吕健;余丹丹;姚火春;袁世山;;猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合感染性克隆的构建和应用[J];生物工程学报;2008年09期

6 韩秀娥;全滟平;高旭;相文华;周建华;;马传染性贫血病毒N-连接糖基化回复突变的感染性克隆构建[J];微生物学报;2008年03期

7 朱丽杰;李刚;曲哲会;王君伟;;口蹄疫病毒全长cDNA感染性克隆的研究进展[J];黑龙江畜牧兽医;2008年02期

8 吴海祥,张楚瑜;正链RNA病毒基因组感染性克隆研究进展[J];武汉大学学报(理学版);2002年04期

9 邵小雪;周双海;谢俊岭;冉多良;;猪圆环病毒1型感染性克隆的构建[J];中国兽医科学;2011年02期

10 邹兴启;赵启祖;范运峰;朱元源;王琴;徐璐;范学政;宁宜宝;;猪瘟病毒C株全长cDNA感染性克隆的构建及病毒拯救[J];中国农业科学;2011年02期

相关会议论文 前10条

1 周双海;谢俊岭;;猪圆环病毒2型感染性克隆构建的比较分析[A];“生泰尔”杯全国养猪技术征文大赛——中国畜牧兽医学会养猪学分会五届三次理事会暨生猪产业科技创新发展论坛论文集[C];2012年

2 刘长明;危艳武;陆月华;张朝霞;袁婧;黄立平;;猪圆环病毒1型感染性克隆的构建与病毒拯救[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文集[C];2008年

3 李祥健;张建武;吕健;余丹丹;姚火春;袁世山;;猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合感染性克隆的构建和应用[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第三届猪病防控学术研讨会论文集[C];2008年

4 李薇;余兴龙;罗维;白霞;李润成;黎满香;葛猛;王亚;向卫军;李晶;;三种亚群PCV-2感染性克隆的构建及体内外感染性试验[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集（上册）[C];2009年

5 徐卓菲;司有辉;刘瑞峰;钱平;李祥敏;陈焕春;;猪瘟病毒兔化弱毒株感染性克隆平台的构建[A];2006年度学术研讨会论文摘要汇编[C];2006年

6 陈义锋;赵亚荣;赵建增;;PRRSV感染性克隆及其在疫苗研究中的应用[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第三届猪病防控学术研讨会论文集[C];2008年

7 张考;仲飞;李秀锦;陈慧慧;李文艳;温洁霞;;含绿色荧光蛋白基因的PRRSV感染性克隆的制备及特性分析[A];全国动物生理生化第十二次学术交流会论文摘要汇编[C];2012年

8 孔义波;张兴晓;姜世金;赵钦;孙亚妮;;内源性禽白血病病毒SD0501株感染性克隆的构建及鉴定[A];山东畜牧兽医学会禽病学专业委员会第一次学术研讨会论文集[C];2009年

9 潘梦;杨小蓉;郭鑫;张大丙;杨汉春;;3型鸭甲肝病毒C-GY株全长感染性克隆的构建和病毒拯救的鉴定[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十五次学术研讨会论文集[C];2010年

10 李爽;章丽娇;孙海港;苏文良;韩博;苏敬良;;鸭BYD病毒全长感染性克隆的构建与拯救病毒鉴定[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次人兽共患病学术研讨会暨第六届第十四次教学专业委员会论文集[C];2012年

相关博士学位论文 前10条

1 陈浩;坦布苏病毒ZC株感染性克隆的构建和部分3’非编码区功能的初步研究[D];山东农业大学;2015年

2 黄柏成;高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆的构建及其在病毒可视化示踪上的研究和应用[D];西北农林科技大学;2015年

3 郗冀;新型水貂阿留申病毒感染性克隆的构建及其生物学特性鉴定[D];中国农业大学;2016年

4 张善瑞;高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒及其弱毒感染性克隆的构建和应用[D];中国农业科学院;2010年

5 黄勤锋;猪繁殖与呼吸综合征病毒的感染性克隆及其复制子载体的研究[D];华中农业大学;2009年

6 于可响;鸭坦布苏病毒生物学特性、基因组特征、诊断方法以及感染性克隆的研究[D];扬州大学;2013年

7 于敏;猪戊型肝炎病毒全基因组序列分析及感染性克隆的构建[D];东北农业大学;2007年

8 耿合员;人冠状病毒NL63中国株全基因组的测序与感染性克隆构建[D];中国疾病预防控制中心;2014年

9 张辉;伪狂犬病毒间质蛋白UL14功能研究及TK～-/gG～-株感染性克隆构建[D];华中农业大学;2007年

10 刘少宁;PRRSV不同毒株感染MARC-145细胞的蛋白质组学分析及ZCYZ株感染性克隆的拯救[D];山东农业大学;2012年

相关硕士学位论文 前10条

1 王利月;表达绿色荧光蛋白的北美Ⅱ型PRRSV感染性克隆的制备及特性分析[D];河北农业大学;2015年

2 张潞;牛1型腺病毒感染性克隆的构建及拯救[D];西北农林科技大学;2015年

3 李丹丹;犬瘟热病毒SH株的分离鉴定及其感染性克隆的构建[D];西北农林科技大学;2016年

4 赵款;PRRSV HuN4株和CH-1a株感染性克隆及其嵌合病毒的构建及其初步应用[D];中国农业科学院;2016年

5 王伟丞;携带遗传标记的猪圆环病毒2型贵州分离株感染性克隆的构建[D];贵州大学;2015年

6 田敬;鹅圆环病毒感染性克隆的构建及其转染试验[D];浙江大学;2010年

7 吴星星;猪圆环病毒2型新疆株的分离鉴定及感染性克隆的构建[D];新疆农业大学;2012年

8 李祥健;猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合感染性克隆的构建和应用[D];南京农业大学;2008年

9 钟志成;带有绿色荧光蛋白标记的中国马传染性贫血病毒疫苗株感染性克隆的构建[D];南方医科大学;2010年

10 李长龙;猪嵴病毒全长cDNA感染性克隆的构建及拯救[D];中国农业科学院;2014年

，

本文编号：1538574