ACAA2基因对绵羊前体脂肪细胞分化的影响及其相关育种材料创制

发布时间：2018-02-26 16:04

  本文关键词： ACAA2 CRISPR/Cas9 前体脂肪细胞　出处：《扬州大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：脂肪组织是一个具备能量储存和分泌激素功能的内分泌器官,脂肪组织如果过度生长和发育,即体脂过度沉积在引起人类肥胖症状发生的同时也会引发诸如糖尿病、脂肪肝、胆囊疾病、高血压、内分泌紊乱等相关疾病,在畜牧业生产上可以降低动物胴体的瘦肉率,会对肉品质造成一定的影响。前体脂肪细胞是具有增殖和向脂肪细胞分化能力的特异化细胞,体脂沉积是前体脂肪细胞增殖和分化的结果,因此,研究前体脂肪细胞分化的调控机理能够为控制体脂沉积提供理论基础,为家畜育种和动物生产提供参考。ACAA2(acetyl-Coenzyme A acyltransferase2)是脂肪酸氧化步骤中的关键酶,它催化脂肪酸β的氧化。研究表明,ACAA2是参与脂类代谢通路的关键基因,在pathway中占据节点位置,初步确立该基因为影响脂类代谢的关键基因。前人都基于在分子水平上对ACAA2的多态性进行研究,关于ACAA2在调控前体脂肪细胞向脂肪细胞分化过程的机制研究的还不是很清楚,为了探索其在细胞分化过程中的作用,本研究以ACCA2为研究对象,以分离的绵羊原代前体脂肪细胞为研究媒介,应用CRISPR/Cas9介导的基因敲除与基因过量表达技术,探讨ACAA2在调控绵羊前体脂肪细胞分化中的作用。主要研究内容如下:1.通过体外PCR扩增ACAA2的编码区,琼脂糖凝胶电泳结果显示条带大小与预期一致,测序结果NCBI上与绵羊比对同源性为100%。生物信息学分析结果表明:绵羊ACAA2共编码397个氨基酸,理论等电点为5.06,是一种酸性蛋白,该蛋白为疏水性蛋白。ACAA2蛋白没有信号肽,该蛋白含有4个磷酸化位点,4个N-糖基化位点,10个O-糖基化位点。该蛋白二级结构中含有15个α螺旋(Alpha helix),27个β折叠(Beta turn),18个Turn转角,16个Coil卷曲螺旋。系统进化树分析显示绵羊ACAA2蛋白与山羊进化关系密切。2.ACAA 敲除载体及过表达载体构建及活性验证:目的基因连接pcDNA3.1过表达载体后用EcoR I和Kpn I进行双酶切获得ACAA2目的条带,连接产物测序结果表明ACAA2-pcDNA3.1过表达载体构建成功。设计3个gRNA靶位点,Cas9体外酶切检测靶点的效率,酶切活性分别为60%、73%、75%,选取活性最高的gRNA5靶点进行内源活性验证,结果表明突变型基因组成功被T7E1酶剪切出740bp和454bp两条条带,显示该靶点具有兼具外源和内源活性,符合后期实验要求。将活性最高的ACAA2-Cas9/gRNA敲除载体转染绵羊耳样成纤维细胞,当质粒质量与脂质体体积比分别为1:1、1:2.5、1:3时转染效率分别为30%、50%、75%,确定最佳转染条件为1:3。3.ACAA2敲除和过表达影响前体脂肪细胞分化的研究:采集3月龄羊尾部、皮下脂肪组织,获得的较高纯度的前体脂肪细胞的生长曲线呈“S”型,基本符合体外前体脂肪细胞的生长增值规律。前体脂肪细胞经过INS+DEX+IBMX诱导分化后,胞内脂滴数量增多,并出现标志性的“脂环”。诱导分化后的细胞被油红O染成橘红色,前体脂肪细胞成功被诱导成脂肪细胞。将ACAA5-gRNA5、ACAA2-pcDNA3.1分别转染绵羊前体脂肪细胞48h后诱导分化培养基诱导,经油红O染色发现,ACAA5-gRNA5转染组诱导6d和10d后,脂滴数量明显低于对照组,ACAA2-pcDNA3.1组诱导6d和10d后,脂滴数量明显增加。对照组、ACAA2-gRNA组、ACAA2-pcDNA3.1组PPARγ的表达量分别为1.00±0.01、0.42±0..12、1.5士0.27;LPL 的表达量为 1.00±0.10、0.37±0.15、1.47±0.16;AP2的表达量为1.00±0.06、0.30±0.10,1.32±0.08,敲除组基因的表达量与对照组相比均显著下调,过表达组基因的表达量与对照组相比均显著上调。说明敲除ACAA2,抑制脂滴形成,抑制前体脂肪细胞分化;过表达ACAA2,促进脂滴形成,促进前体脂肪细胞分化。
[Abstract]:ACAA is a key gene involved in lipid metabolism . The results show that ACAA2 is a key gene involved in the differentiation of fat cells . The results show that ACAA2 is a key gene involved in the differentiation of fat cells . The results showed that the growth curve of the preadipocytes was 1 鈭，

本文编号：1538696