哈尔滨市鸡缺硒性疾病流行病学调查及硒蛋白K生物学功能的初步研究

发布时间：2018-03-03 00:39

本文选题：鸡缺硒性疾病　切入点：流行病学调查　出处：《东北农业大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：硒(Se)作为一种必需的微量元素,对于维持人和动物机体正常生命活动起着非常重要的作用。硒缺乏可导致鸡的脑、心脏、肝脏、胰腺及肌肉等组织、器官的损伤甚至死亡,因此硒缺乏性疾病成为了危害养禽业的主要营养代谢性疾病之一。原发的硒缺乏性疾病具有明显的地域性,因此地区性的鸡缺硒性疾病的流行病学调查将为合理防治该病提供有力的参考。硒在生物体内主要是通过硒蛋白(Selenoprotein)来发挥其生物学功能,其中硒蛋白K(Selk)是近几年才被揭示的一种定居在内质网上的小分子硒蛋白。研究证明哺乳类动物Selk的缺失可以引起T淋巴细胞的增殖、迁移受阻,巨噬细胞功能障碍,细胞因子分泌紊乱,机体免疫功能失衡,抗病毒能力下降。在禽类,初步研究发现,Selk具有抗氧化和钙稳态调控的功能并且参与缺硒性骨骼肌损伤,但是Selk在鸡体内的具体生物功能还未揭示。哈尔滨市地处硒缺乏区域,是鸡硒缺乏性疾病的高发区,为了明确哈尔滨市该病的发病情况及阐明硒蛋白K的生物学功能。本研究对该地区鸡缺硒性疾病进行了流行病学调查;复制了鸡硒缺乏症模型,检测了骨骼肌中炎症、内质网应激及凋亡等相关指标;建立了Selk敲低鸡胚成肌细胞模型,检测氧化应激、硒蛋白、炎症因子、热休克蛋白、钙稳态、糖代谢及肌肉发育等相关指标;通过生物信息学预测了靶向Selk的micro RNA(mi RNA)以及靶向硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)的long non coding RNA(lnc RNA),利用双荧光素酶报告基因检测mi RNA与Selk的靶向关系;建立了lnc RNA敲低鸡胚成肌细胞模型,检测lncRNA与SCD的靶向关系及炎症等相关指标;建立了gga-let-7f-3p过表达和敲低的鸡胚成肌细胞模型及N-乙酰半胱氨酸(NAC)与过氧化氢(H2O2)的处理模型,检测了氧化应激、内质网应激与凋亡等相关指标;建立了gga-let-7f-3p过表达和敲低鸡胚成肌细胞模型,经禽流感病毒(H5N1)进行处理后,检测其中的病毒复制能力及自噬相关指标。试验结果如下:(1)流行病学调查结果显示,2014年至2016年间,哈尔滨市鸡缺硒性疾病,从9月份开始,占接诊病例的百分率陡增(2014年为0.77%,2015年为0.71%,2016年为0.52%);12月份该百分率达到高峰(2014年为3.39%,2015年为3.24%,2016年为2.47%)后开始下降,1月份该百分率降为1.01%(2014年)、1.68%(2015年)与2.04%(2016年)。这提示入冬之后该病的发病率显著上升,说明该病具有明显的季节性,特定的气候因素(特别是低气温)对该病的发生及发展有重要的影响。另外,该病在肉鸡中的发病率显著高于蛋鸡,进一步研究发现4周龄的肉鸡与产蛋期蛋鸡发病率最高。这提示哈尔滨地区进入9月份后要加强饲料中维生素E及硒含量的监测,做到及时发现缺乏,从而及时准确进行补充。(2)Selk敲低显著影响了鸡胚成肌细胞中25种硒蛋白的表达,Selk敲低24h后,Txnrd1、Txnrd3、Seln、Sels、Selt、Selm、Sep15、Seli、Selo与Sepx1 mRNA的表达量显著上升,而Gpx1、Gpx2、Gpx4、Dio3、Selw、Selh与Sepp1 mRNA的表达量显著下降;Selk敲低48h后,Gpx2与SPS2 mRNA的表达量显著上升,而Gpx1、Gpx2、Gpx4、Txnrd1、Txnrd2、Txnrd3、Dio3、Seln、Sels、Selw、Selt、Selh、Selm、Sep15、Seli、Selu、Sepp1、Selo与Sepx1 m RNA的表达量显著下降;Selk敲低72h后,Txnrd1、Txnrd2、Txnrd3、Seln、Selt、Selm、Seli、Selo、Sepx1与SPS2 m RNA的表达量显著上升,而Gpx3、Dio2、Dio3与Selh m RNA的表达量显著下降。结果表明Selk具有调节其他硒蛋白表达的功能。(3)硒缺乏可导致骨骼肌出现炎症及出血等典型的病理学变化,并且显著下调了骨骼肌中Selk、ALDBGALG0000005049、SCD、PPARα、PPARβ及PPARγ的表达,上调了IL-1β、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-17及CCL4的表达;Selk敲低显著影响了鸡胚成肌细胞中iNOS、NF-κB、HO-1、COX-2、PTGEs、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-17及IFN-γ的表达,并且下调了ALDBGALG0000005049及SCD的表达;ALDBGALG0000005049靶向调控SCD表达,敲低ALDBGALG0000005049显著下调了鸡胚成肌细胞中SCD、PPARα、PPARβ及PPARγ的表达,上调了IL-1β、IL-6、IL-8及CCL4的表达。结果表明Selk通过调控ALDBGALG000000504-SCD通路诱导鸡骨骼肌炎症参与硒缺乏性骨骼肌损伤。(4)硒缺乏显著上调了骨骼肌中ATF4、ATF6、XBP1、CHOP与Bax的表达,下调了Bcl2的表达;gga-let-7f-3p靶向调控Selk表达;过表达gga-let-7f-3p增加了鸡胚成肌细胞中SOD和CAT的活性以及ROS和MDA的水平,上调了ATF4、ATF6、XBP1、CHOP与Bax的表达,下调了Bcl2的表达,诱发细胞凋亡,这种影响可以被NAC所阻遏。敲低gga-let-7f-3p可阻遏H2O2诱导成肌细胞凋亡。结果表明gga-let-7f-3p可靶向Selk诱导鸡骨骼肌凋亡参与硒缺乏性骨骼肌损伤。(5)H5N1可感染鸡胚成肌细胞,并诱发鸡胚成肌细胞自噬的产生。gga-let-7a-3p靶向调控Selk表达;敲低gga-let-7a-3p上调鸡胚成肌细胞BECN1表达,下调了HA、M1、M2、mTOR、LC3-1及P62的表达。结果表明敲低gga-let-7a-3p可通过上调Selk,抑制M2的表达,解除了M2对自噬溶酶体形成的阻碍,从而抑制H5N1在鸡胚成肌细胞中的复制。(6)Selk敲低24h与72h,鸡胚成肌细胞中ITPR1、ITPR2、ITPR3、RyR1、RyR3、NCX、PMCA1、CACNA1S、TRPC1、TRPC3、STIM1、ORAl1、Ca LM、Ca SR、MSTN与P21的mRNA表达量显著上升;SERCA1s与CRT的mRNA表达量在Selk敲低24h显著上升,而在72h显著下降;Myo D与Myf-5的m RNA表达量在Selk敲低24h后显著下降,而在72h显著上升;Selk敲低72h,IRS1、IRS2、IGF1、GLUT1、GLUT3、GLUT8、MRF4与Myogenin的m RNA表达量显著下降。相关性分析与主成分分析表明IRS1、IRS2、IGF1、GLUT1、GLUT3与GLUT8显著影响MRF4及Myogenin,ITPR3、RyR1、PMCA1、CACNA1S、STIM1、Ca LM与CRT显著影响Myogenin。因此Selk敲低显著影响了鸡胚成肌细胞中的糖代谢与钙稳态,从而影响鸡胚成肌细胞的增殖与分化,尤其影响了鸡胚成肌细胞的分化阶段。结果表明Selk具有维持鸡胚成肌细胞正常发育的功能。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.31

【参考文献】