抗新城疫病毒单链抗体（scFv）载体构建及表达研究
本文选题：新城疫病毒 切入点：单链抗体 出处：《广西大学》2015年硕士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一类禽类呼吸道疾病,感染宿主高度致死,因此对中国乃至全球的家禽业造成巨大的威胁,至今仍无特异性治疗药物。单链抗体(scFv)是免疫球蛋白最小的功能性结构单元,具有抗原结合活性,且在脊椎动物与非脊椎动物中均能表达。单链抗体除了应用于医学诊断与治疗,还具有中和病毒的能力。本研究探索利用PiggyBac转座子系统构建抗新城疫病毒单链抗体真核表达载体,分别为pB315B-CAG-puro-pGFP-scFv、pB315B-EF1α-puro-pGFP-scFv。通过脂质体LipofectamineTM2000将构建的两个重组质粒分别转染DF-1细胞和293T细胞,获得了稳定转染抗新城疫病毒单链抗体的DF-1-CAG-scFv、 293T-CAG-scFv、DF-1-EF1α-scFv与293T-EF1α-scFv等4种细胞系。PiggyBac转座子系统在DF-1和293T细胞中的转座效率分别为19.1%和25.8%。RT-PCR结果表明,抗新城疫病毒单链抗体基因在4种细胞中均检测到mRNA。通过western blot检测与抗新城疫病毒单链抗体融合的His标签蛋白来确定其在各细胞系中的表达情况,结果表明,在上述4种转染细胞的裂解液中均没有检测到His标签蛋白,然而在DF-1-EF1α-scFv和DF-1-CAG-scFv细胞上清中有scFv表达,前者含量高于后者。利用6倍、60倍、600倍TCID50的新城疫病毒分别感染DF-1、DF-1-CAG-scFv和DF-1-EF1α-scFv细胞。结果表明,当新城疫病毒量为60TCID50与600TCID50时,DF-1与DF-1-CAG-scFv细胞发生病变的孔数明显多于DF-1-EF1α-scFv。本实验表明,EF1α启动子对单链抗体的表达翻译效果更好,利用该启动子构建的新城疫病毒单链抗体能够在DF-1细胞中稳定表达,并分泌到细胞外,具有良好的抗新城疫病毒效果。将以EF1α为启动子的抗新城疫病毒单链抗体质粒转染鸡原始生殖细胞(PGCs),24 h后的转染效率为2.9%,经嘌呤霉素筛选后得到稳定表达抗新城疫病毒单链抗体的PGCs细胞系。本研究为抗新城疫病毒单链抗体的转基因鸡的生产奠定了基础。
[Abstract]:Newcastle disease (NDV) is a kind of respiratory disease of poultry caused by Newcastle disease virus (NDV). It is highly lethal to the host, so it poses a great threat to the poultry industry in China and even the whole world. ScFvv is the smallest functional structural unit of immunoglobulin with antigen-binding activity. It can be expressed in both vertebrates and non-vertebrates. ScFv is used in medical diagnosis and treatment. In this study, PiggyBac transposon system was used to construct eukaryotic expression vector of single chain antibody against Newcastle disease virus, pB315B-CAG-puro-pGFP-scFv-pB315B-EF1 伪 -puro-pGFP-scFv.Two recombinant plasmids were transfected into DF-1 cells and 293T cells by liposome LipofectamineTM2000. Four cell lines, DF-1-CAG-scFvv, 293T-CAG-scFvv, DF-1-EF1 伪 -scFv and 293T-EF1 伪 -scFv, which were stably transfected into DF-1 and 293T cells, were obtained. The translocation efficiency of PiggyBac transposition subsystem in DF-1 and 293T cells was 19.1% and 25.8.RT-PCR, respectively. The anti-Newcastle disease virus single-chain antibody gene was detected in all four kinds of cells. The expression of mRNA in all cell lines was determined by western blot detection and His tag protein fusion with anti-Newcastle disease virus single chain antibody. No His tag protein was detected in the lytic fluid of the four transfected cells, but scFv was expressed in the supernatant of DF-1-EF1 伪 -scFv and DF-1-CAG-scFv cells. The content of the former was higher than that of the latter. Newcastle disease virus (NDV) was infected with DF-1-CAG-scFv and DF-1-EF1 伪 -scFv cells using 6 times 60 times TCID50. When Newcastle disease virus was 60 TCID50 and 600TCID50, the number of holes in DF-1 and DF-1-CAG-scFv cells was significantly higher than that in DF-1-EF1 伪 -scFv. the results showed that EF1 伪 promoter was more effective in the translation of scFv. The Newcastle disease virus single chain antibody constructed by the promoter could be stably expressed in DF-1 cells and secreted into the cells outside the cells. The single chain antibody plasmids with EF1 伪 as promoter were transfected into chicken primordial germ cells for 24 h. The transfection efficiency was 2.9%. After screening with purine mycin, stable expression of anti-Newcastle disease virus was obtained. This study laid a foundation for the production of transgenic chicken against Newcastle disease virus single chain antibody (scFv).
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 ;Novel Selenium-containing Human Single-chain Variable Fragment with Glutathione Peroxidase Activity from Computer-aided Molecular Design[J];Chemical Research in Chinese Universities;2011年05期
2 管海宏,付萌,李巍,夏汝山,王刚,刘玉峰;天然抗角蛋白单克隆抗体3B4的噬菌体呈现的scFv的构建及表达[J];细胞与分子免疫学杂志;2005年04期
3 秦娜;;丙溴磷人源ScFv抗体的筛选与鉴定[J];太原师范学院学报(自然科学版);2008年02期
4 武国军,郝晓柯,王禾,白玉杰,张盈华,药立波,范金水;Construction and expression of the single-chain Fv gene specific for humanγ-seminoprotein[J];Journal of Medical Colleges of PLA;1999年04期
5 尹惠琼,范泉水,谭德勇,王双印,孙阳,李刚山,邱薇,余敏;抗五步蛇毒ScFv噬菌体显示文库的构建及表达[J];中国免疫学杂志;2004年05期
6 ;Antitumor effects of an engineered and energized fusion protein consisting of an anti-CD20 scFv fragment and lidamycin[J];Science China(Life Sciences);2011年03期
7 ;Generation and Characterization of C305,a Murine Neutralizing scFv Antibody That Can Inhibit BLyS Binding to Its Receptor BCMA[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2005年06期
8 陈樱;邓国华;陈化兰;;抗H5N1亚型高致病性禽流感猴源噬菌体scFv的构建和表达[J];中国预防兽医学报;2010年04期
9 ;The inhibition of lung cancer cell growth by intracellular immunization with LC-1 ScFv[J];Cell Research;2002年01期
10 余自强;董宁征;白霞;戴兰;阮长耿;;抗血小板糖蛋白VI单链抗体的制备和功能研究[J];现代免疫学;2006年01期
相关会议论文 前10条
1 ;Preparation of Anti-Fumonisin B_1 Single Chain Antibody Fragment(scFv)and Establishment of Detection System for Fumonisin B_1[A];第九届中国生物毒素学术研讨会论文摘要[C];2009年
2 ;Construction,Expression and Activity Identification of anti-LMP1scFv/tP Fusion Protein[A];2008年全国生物化学与分子生物学学术大会论文摘要[C];2008年
3 ;Construction of mouse scFv phage display library against tetrodotoxin and Establishment of TTX's Detection System[A];第九届中国生物毒素学术研讨会论文摘要[C];2009年
4 ;Construction of Fusion Protein scFv-PhoA for the Immunodetection of DON[A];2005全国第二届核酸疫苗研讨会论文集[C];2005年
5 汤正好;余永胜;江红;奚敏;臧国庆;;非复制型腺病毒介导抗HBc ScFv细胞内表达和鉴定[A];中华医学会第十二次全国病毒性肝炎及肝病学术会议论文汇编[C];2005年
6 尹继刚;张西臣;李建华;朱平;柳增善;杨举;张国利;;抗隐孢子虫ScFv-PE40重组毒素表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达[A];中国动物学会原生动物学分会第十二次学术讨论会论文摘要汇编[C];2003年
7 张果;崔恒;昌晓红;成夜霞;付天云;石菁菁;李巍;;重组6B11ScFv／Hsp70融合蛋白的构建、表达及活性测定[A];中华医学会第一届全球华人妇产科学术大会暨第三次全国妇产科中青年医师学术会议论文汇编[C];2007年
8 ;Construction of an Anti-human Melanoma Immunocytokine ScFv-mTNF-α and Study on its Anti-tumor Effects[A];2008年全国生物化学与分子生物学学术大会论文摘要[C];2008年
9 Zhujun Wang;Yuanyuan Chen;Sisi Li;Yuping Chen;Haizhao Zhao;Ming Jia;Zebin Luo;Yongmin Tang;;Successful construction and stable expression of an anti-CD45RA scFv-EGFP fusion protein in Chinese hamster ovary cells[A];2013年国家级“恶性血液系统疾病诊治新进展”学习班暨学术年会资料汇编[C];2013年
10 张玉静;高士争;刘松财;郝军元;;抗猪脂肪细胞特异膜蛋白scFv基因地克隆及序列分析[A];动物生理生化学分会第八次学术会议暨全国反刍动物营养生理生化第三次学术研讨会论文摘要汇编[C];2004年
相关博士学位论文 前10条
1 高维;重组人源抗-CTGF scFv二聚体在ASM细胞增殖及化疗药物引起肺纤维化作用中的研究[D];东南大学;2016年
2 郭军庆;免疫细胞因子IP10-scFv的构建及其抗肿瘤特性研究[D];武汉大学;2003年
3 张晓;全人源抗H5N1型禽流感病毒scFv广谱中和抗体的制备、鉴定及保守中和表位的分析[D];南京医科大学;2011年
4 李亮;抗Ⅳ型胶原酶单抗scFv片段与力达霉素构建的基因工程强化融合蛋白及其抗肿瘤作用的研究[D];中国协和医科大学;2003年
5 王柱军;靶向白血病干细胞新单抗3A4的人源化研究[D];浙江大学;2014年
6 王旋;双功能抗体融合蛋白IP10-scFv定向募集T淋巴细胞靶向治疗鼠脑恶性胶质瘤的研究[D];华中科技大学;2012年
7 石君帆;人源性噬菌体抗体库与rhG-CSF基因工程ScFv抗体的研究[D];浙江大学;2004年
8 刘俐伶;重组免疫毒素CD25scFv-α-luffin-KDEL的体外靶向生物学活性研究[D];第三军医大学;2010年
9 闫博;免疫促凋亡分子scFv15-Fdt-HA2-tBid的基因构建、表达及对HBsAg阳性肝细胞癌的杀伤作用[D];第四军医大学;2011年
10 朱志强;皖南尖吻蝮蛇毒素AaHIV，acucetin的结构功能研究及P185抗体ScFv-A21的结构生物学研究[D];中国科学技术大学;2009年
相关硕士学位论文 前10条
1 于佳;产气荚膜梭菌α毒素表达、纯化及人源scFv抗体筛选[D];吉林农业大学;2015年
2 汤沁;胃癌单链抗体和免疫毒素scFv-TCS的制备和抗肿瘤作用研究[D];浙江大学;2014年
3 张珍珍;抗CD33单链抗体及免疫毒素scFv-Gz B的制备及活性检测[D];浙江大学;2014年
4 赵吉建;有机磷农药ScFv抗体的筛选研究[D];西北农林科技大学;2015年
5 吕欣欣;重组免疫毒素Gigantoxin-4-4D5 scFv的制备、体外活性研究及链接优化[D];华东理工大学;2016年
6 彭三凤;抗新城疫病毒单链抗体（scFv）载体构建及表达研究[D];广西大学;2015年
7 陈磊;人抗狂犬病毒小分子抗体ScFv-Fc在毕赤酵母中的表达与鉴定[D];吉林大学;2007年
8 赵杨;催化模块组装含硒单链抗体模拟GPx及活性研究[D];吉林大学;2012年
9 于颖;PRRSV GP5蛋白抗独特型单链抗体的构建表达与鉴定[D];山东农业大学;2011年
10 刘美云;从噬菌体抗体库中淘选B淋巴细胞刺激因子（BlyS）的中和抗体[D];暨南大学;2005年
，本文编号：1569335
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/1569335.html
