鸡空肠弯曲杆菌CadF蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

发布时间：2018-03-05 21:04

  本文选题：空肠弯曲杆菌　切入点：CadF蛋白　出处：《东北农业大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni),是一种食源性致病菌,近年来,由其引发的食品安全问题日益突出。全世界每年有大约4-5亿人感染该菌,主要临床表现是以呕吐、腹泻症状的空肠弯曲杆菌肠炎,甚至继发格林-巴利综合征(Guillain-Barri syndrome,GBS)。开展流行病学调查并对该病进行实时监测是有效控制该菌感染的根本途径,一种快速、准确、敏感性强、适应性强的检测方法亟需建立。本研究以C.jejuni Q11株为研究对象,DNAStar软件进行序列分析并设计引物,PCR方法扩增目的基因cad F,然后利用p ET32a对cad F基因进行原核表达,构建重组质粒pET32a-Cad F,并将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,在37℃条件下,以1mmol/L IPTG对重组蛋白进行诱导表达。诱导表达后的重组蛋白通过SDS-PAGE及Western blot进行验证。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白pET32a-Cad F分子量大小为53 ku,以包涵体形式存在于沉淀中;Western blot分析表明,该蛋白可与空肠弯曲杆菌全菌阳性血清产生特异性反应,具有良好的反应原性。采用亲和层析的方法对带有His-Tag标签的蛋白进行纯化,以复性的蛋白作为抗原建立了检测空肠弯曲杆菌血清的间接ELISA方法。对间接ELISA方法的条件进行优化,采用Cut-Off值法确定间接ELISA的阴阳临界值。最终确定所建立方法的最佳条件是:在37℃条件下,抗原包被浓度为1.05μg/m L;包被时间为2 h;封闭条件为5%脱脂乳封闭1 h;阳性血清稀释倍数为1:100,作用时间为45 min;二抗作用浓度和时间分别为1:5000、45 min,显色时间为10 min,临界值为0.339。利用大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌等常见鸡病的阳性血清验证所建立检测方法的敏感性、批内重复性及批间重复性验证对该方法的可重复性进行了解,结果表明此方法具有良好敏感性、重复性及特异性;对血清样品检测表明:该方法可应用于临床样品的初步检测。所建立间接ELISA方法不仅为空肠弯曲杆菌的流行病学调查提供了初步检测方法,更为疾病的预防和控制提供有效依据。
[Abstract]:Campylobacter jejunianus, a foodborne pathogen, has been causing increasing food safety problems in recent years. About 400 million people worldwide are infected with the bacterium each year, the main clinical manifestation of which is vomiting. Campylobacter jejuni enteritis with diarrhea symptoms, and even Guillain-Barri syndromefus GBSN secondary to Guillain-Barri syndromefus syndrome. Epidemiological investigation and real-time monitoring of the disease are the fundamental ways to effectively control the infection of Campylobacter jejuni. It is a rapid, accurate and sensitive way to control the infection of Campylobacter jejuni. In this study, the sequence analysis of C. jejuni Q11 strain was carried out, and a primer PCR method was designed to amplify the target gene cad F, and then prokaryotic expression of cad F gene was carried out by p ET32a. The recombinant plasmid pET32a-Cad F was constructed, and the recombinant plasmid was transferred into Escherichia coli BL21 (DE3) competent cells. At 37 鈩，

本文编号：1571878