鹅肥肝形成过程中差异表达miRNA筛选及miRNA-33的表达调控研究

发布时间：2018-03-06 06:07

本文选题：鹅　切入点：肥肝　出处：《扬州大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：microRNA(miRNA)是一类长约21-23nt的非编码RNA分子,其对基因的后转录调控发挥重要作用。已有研究表明miRNA在人和小鼠肝脏脂肪代谢障碍中起着重要调控作用。鹅肝脏沉积脂肪能力很强但不会有明显的病理症状,是研究肝脏脂类代谢很好的模型。本研究采用第二代高通量测序方法,检测鹅肥肝形成中差异表达的miRNA,利用生物信息学方法预测miRNA的靶基因,同时结合前期转录组测序研究结果,构建miRNA与基因间调控网络,筛选出可能起核心作用的miRNA和靶基因。然后从筛选结果中挑选部分重要miRNA和对应靶基因(miRNA-33和CROT基因),利用鹅原代肝细胞分离培养技术、荧光定量PCR技术、Western Blot等技术进行靶向关系验证及调控机制研究,为进一步阐明鹅肥肝形成的分子机制奠定基础。本研究的主要结果如下:1.朗德鹅填饲效果及小RNA测序质量:70日龄的朗德鹅在经过19天的填饲后,较对照组其体重和肝重均发生显著的增长(P0.05)。其中,填饲组和对照组鹅体重分别为7.57 ±0.48 kg 以及 3.87 ±0.25 kg(n=6),肝重分别为 826.26 ± 182.26 g 和 80.63 ± 12.80 g,肝体比(肝重/体重)分别为10.86%和2.08%。同时,填饲组鹅肝脏的颜色也由正常的深红色变为脂肪肝典型的黄褐色,表明填饲后实验鹅确实产生了明显的脂肪肝。对送测样本的RNA进行质量检测表明,RNA的样品浓度≥80ng/μL,RNA无降解,无污染,总体质量较高。2.鹅肥肝形成过程中差异miRNA分析及调控网络构建:通过对鹅不同填饲阶段(7天、14天和19天)填饲组和对照组的肝脏进行小RNA测序,并对原始数据进行过滤、拼接和注释,最终获得了 1163个有注释信息的miRNA。在77日龄、84日龄、89日龄三个时间点比较填饲组和对照组不同阶段肝脏miRNA表达的差异,结果在三个时间点分别筛选出30(17个填饲组上调)、48(36个填饲组上调)和151(114个填饲组上调)个差异表达的miRNA。结合前期转录组测序数据对差异miRNA进行靶基因预测,在77日龄、84日龄、89日龄三个时间点分别获得234个、445个、845个预测靶基因,其中在填饲组上调的预测靶基因分别为156个、270个、211个。对获得的预测靶基因进行KEGG pathway富集分析发现,起关键调控作用的显著富集通路包括:碳水化合物、脂质和氨基酸代谢通路,细胞生长死亡通路,免疫系统通路等。以差异表达miRNA的靶基因预测结果为基础,使用STRING数据库预测靶基因的互作关系并构建miRNA与基因间的调控网络。3.miRNA-33及其靶基因CROT的表达调控研究:本课题组在前期的工作中发现miRNA-33与脂肪代谢紧密相关,并通过实验对其靶基因进行了初步的预测和研究,发现CROT基因为其可能的靶基因。本研究结果也发现,miRNA-33在填饲的不同阶段(尤其是填饲后期)均发生了表达量的上调。因此,本试验对miRNA-33及其靶基因CROT的表达调控进行了进一步的研究。荧光定量PCR结果与小RNA测序结果相符,证实了 miRNA-33在填饲各阶段肝脏中均显著上调。此外,miRNA-33在腹脂和胸肌中其表达水平也受填饲的影响而显著升高,表明miRNA确实与填饲引起的脂肪代谢变化相关。进一步研究发现,miRNA-33的预测靶基因CROT基因在填饲各阶段肝脏中的mRNA水平均显著下调,且在19天填饲组中的蛋白表达水平也显著下调,这与miRNA-33的表达趋势正好相反,表明在鹅肥肝形成过程中miRNA-33可能参与CROT基因的表达调控。细胞实验发现,在鹅原代肝细胞中转染miRNA-33 mimic和miRNA-33质粒后,CROT基因的mRNA表达受到了显著抑制;而在鹅原代肝细胞中转染miRNA-33 inhibitor之后,CROT基因的mRNA表达则显著升高,表明CROT基因确实为miRNA-33的靶基因。使用脂肪肝形成相关因子(葡萄糖和胰岛素)处理鹅原代肝细胞发现,葡萄糖处理可以显著抑制miRNA-33的表达并诱导CROT基因,而胰岛素则可以显著诱导miRNA-33的表达并抑制CROT基因的表达。该结果不仅进一步证实了 miRNA-33与CROT基因的靶向调控关系,而且说明填饲引起的鹅肝脏中发生的高胰岛素血症可能是导致miRNA-33表达上调的主要原因之一,继而调控CROT基因,参与鹅肥肝的形成。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S835

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