喹赛多对DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质结构的影响

发布时间：2018-03-13 14:53

  本文选题：喹赛多　切入点：生长发育　出处：《华中农业大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：喹赛多是抗菌促生长作用较好的一种喹VA啉类药物,其对动物机体的生长发育产生重要影响,适合用于食品动物的养殖业。虽然目前已有大量关于喹赛多药理学机制的研究,但是喹赛多促生长作用的分子机制仍然不是很清楚。前期已经从喹赛多作用下基因的表达、蛋白和激素的分泌、表型的变化等方面进行了研究,但是由于生物体是一个复杂的体系,其生长受到很多因素的影响,为了更好的说明喹赛多促生长作用仍需从多方面进一步研究。表观遗传学变化主要是指遗传物质的修饰,如DNA的甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑等,这些遗传物质的修饰可以通过影响基因的启动来对基因的表达变化产生调控,进而对机体的生长、发育产生影响。那么喹赛多作用于细胞后是否可以引起机体表观遗传学变化?喹赛多是否可以通过影响表观遗传学变化进而影响机体的生长发育?答案是未知的,仍需进一步研究。在动物机体的生长发育过程中,内分泌系统起着极其重要的作用,其中IGF-1(Insulin-like Growth Factor-1)是机体正常生长发育不可缺少的物质,而肝脏不但是IGF-1的主要分泌器官,而且还是各种不同药物与机体直接接触及在体内进行代谢的主要器官。为了进一步揭示喹赛多的促生长作用机理,本课题以重组生长激素(rGH)为对照药,以基因IGF-1为切入点,以大鼠的肝细胞(BRL细胞)为实验材料进行相应的表观遗传学实验。1.喹赛多于BRL细胞时间和剂量的确定(筛选对细胞生长最有利的条件)本课题采用MTT法,以细胞线粒体内产生的琥珀酸脱氢酶(SDH)的含量为指标,检测药物作用下细胞的活力,并结合细胞生长状态和IGF-1 mRNA表达量来确定喹赛多和对照药物rGH作用于BRL细胞的时间和剂量。实验结果表明,1μmol/L的喹赛多和0.163×2-8 IU/ml的rGH分别作用于BRL细胞4 h后细胞中SDH的含量相对较高,且细胞的生长状况良好,基因IGF-1 mRNA表达水平上调明显,且与生长相关的基因GHR mRNA表达水平和IGF-1R mRNA表达水平也上调明显,对细胞生长发育有利,由此确定可以用1μmol/L的喹赛多和0.163×2-8 IU/m L的rGH分别作用于BRL细胞4 h进行后续的实验。2.喹赛多对BRL细胞内DNA甲基化的影响用1μmol/L的喹赛多和0.163×2-8 IU/mL的r GH(对照药)分别作用于BRL细胞4h,发现喹赛多和rGH都可以引起BRL细胞基因组DNA甲基化水平增加,不利于某些基因的表达,而且BRL细胞基因组DNA甲基化水平会随着喹赛多剂量的增加而改变,不会随着时间的改变而发生变化。用BSP法检测基因IGF-1启动子区域甲基化水平却发现1μmol/L的喹赛多和0.163×2-8 IU/m L的rGH分别作用于BRL细胞4 h后可以引起基因IGF-1启动子区域大部分CpG位点甲基化水平降低,这一现象是有利于转录因子与基因IGF-1启动子区域结合形成转录起始复合物,有利于基因IGF-1的转录,促使IGF-1 mRNA表达水平增加。通过RT-PCR实验发现细胞内DNA甲基化水平的变化可能与DNA甲基化相关酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B有关,可能是药物通过影响DNA甲基化相关酶的变化进而影响细胞内的DNA甲基化水平。3.喹赛多对BRL细胞内组蛋白修饰(H3K4me3和H3K27ac)的影响细胞内组蛋白H3K4me3修饰水平和H3K27ac修饰水平与基因的转录水平有关,对细胞的生长发育产生重要影响。研究发现喹赛多和rGH都可以引起BRL细胞内H3K4me3修饰水平和H3K27ac修饰水平明显降低,且在0~4 h内随着细胞与药物接触时间的增加,BRL细胞内H3K4me3修饰和H3K27ac修饰水平逐渐降低,这一现象对某些基因的转录表达是不利的。通过ChIP-qPCR实验发现,喹赛多和rGH都可以引起BRL细胞内基因IGF-1启动子区域H3K4me3修饰和H3K27ac修饰水平明显增加,促进IGF-1 m RNA表达水平。而且研究发现这些组蛋白H3K4me3修饰水平和H3K27ac修饰水平的增减可能与H3K4me3修饰酶和H3K27ac修饰酶密切相关。4.喹赛多对BRL细胞内染色质结构的影响为了进一步观察喹赛多和对照药rGH作用于BRL细胞后对细胞内染色质结构的影响,我们以细胞内染色质上组蛋白H3K4me3修饰和H3K27ac修饰为参照,结合激光共聚焦显微镜观察喹赛多和对照药物rGH对染色质结构的影响,结果发现,BRL细胞在喹赛多和对照药物rGH作用下BRL细胞核中可见空间变小,染色质之间的空隙变得更大。添加抑制剂5-氮杂-2脱氧胞嘧啶核苷后,与喹赛多处理组和rGH处理组相比,细胞中细胞核内可见空间变大,细胞中染色质之间的空隙变得更小。由此可以推测BRL细胞在喹赛多和rGH作用下染色质结构发生了变化,变得更加疏松,有利于转录起始复合物的形成,可能更有利于基因(如基因IGF-1)的转录和表达。通过对研究结果进行分析,可知:第一,喹赛多和rGH都可能通过调控DNMTs影响细胞内DNA甲基化程度,一方面,引起BRL细胞内基因组DNA甲基化水平增加,抑制某些基因表达,另一方面,却可以引起基因IGF-1启动子区域大部分CpG位点甲基化水平降低,促进基因IGF-1 mRNA表达;第二,喹赛多和rGH都可能通过影响H3K4me3修饰酶和H3K27ac修饰酶,引起BRL细胞内H3K4me3修饰水平和H3K27ac修饰水平在0~4 h逐渐降低,抑制某些基因的表达,但是却可以引起基因IGF-1启动子区域H3K4me3修饰水平和H3K27ac修饰水平明显增加,促进基因IGF-1的转录;第三,BRL细胞在喹赛多和rGH作用下,染色质结构变得更加疏松,有利于转录起始复合物的形成,可能更有利于基因(如基因IGF-1)的转录和表达。本研究首次从表观遗传学变化的多个方面,以rGH为对照药,以细胞整体水平及单个基因IGF-1为切入点,探究喹赛多是否可以引起表观遗传学变化及这些表观遗传学变化与生长发育之间的关系,为进一步说明喹赛多的促生长作用机理提供理论依据,而且本研究也为抗生素促生长作用的研究提供思路和参考。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S859.79

【参考文献】

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本文编号：1606869