PRV感染Neuro-2a细胞中microRNA表达谱的测定

发布时间：2018-03-14 10:54

  本文选题：PRV　切入点：Neruo-2a　出处：《河南农业大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)是α疱疹病毒亚科的重要成员之一,具有神经嗜性和潜伏感染性,给养猪业造成巨大的经济损失。病毒感染宿主后miRNA在疱疹病毒的生活史及病原宿主互作中起到非常重要的调控作用。目前关于PRV体外的研究大多使用PK-15细胞,而在神经细胞上的研究很少见到。本研究旨在建立PRV感染小鼠脑神经瘤细胞(Neuro-2a)的细胞感染模型并测定miRNA表达谱,并对病原与宿主互作的可能机制进行探讨。用PRV感染Neuro-2a细胞后,通过细胞病变观察、TCID50测定、PCR及间接免疫荧光实验,评估了PRV在Neuro-2a内的增殖情况。结果显示,PRV感染后,Neuro-2a产生典型的细胞病变;经TCID50测定发现随着时间的推移,病毒滴度逐渐增高;PCR及间接免疫荧光试验显示PRV可在Neuro-2a上增殖。表明该PRV可适应Neuro-2a细胞,它可用于研究PRV感染、潜伏感染以及致病机制。建立检测PRV IE180、EP0、VP16表达水平的荧光定量方法(qRT-PCR),并用于检测PRV分别感染PK-15细胞及Neuro-2a细胞(MOI=5)后0h、2h、4h、6h,IE180、EP0、VP16的相对表达量。结果表明,在两种不同的细胞内PRV IE180、EP0、VP16的表达趋势存在差异,提示PRV感染上皮细胞及神经细胞时采用的“策略”存在差异。用Solexa测序技术及stem-loop qRT-PCR鉴定PRV感染Neuro-2a细胞后miRNA表达谱。利用生物信息学方法,分析宿主及PRV miRNA针对病毒靶基因的调控网络图以及病毒感染对宿主mi RNA表达谱的影响。高通量的结果显示,4h实验组中检测到PRV编码的mi RNA共7种,分别为prv-miR-LLT1、prv-miR-LLT2、prv-miR-LLT4、prv-miR-LLT5、prv-miR-LLT6、prv-miR-LLT10a、prv-miR-LLT10b。这些miRNA的表达量都很低。28h实验组中检测到PRV编码的miRNA共10种,比4h实验组多出3种,分别为prv-miR-LLT3、prv-miR-LLT11a、prv-miR-LLT11b。28h实验组中PRV编码的miRNA表达量均上调。miRBase数据库中公布的PRV编码的13种miRNA,prv-miR-LLT7、prv-miR-LLT8、prv-miR-LLT9在4h和28h实验组中均未表达。通过比较可知PRV感染Neuro-2a细胞后,有4种宿主mi RNA(miR-146b-5p、miR-714、miR-466k、miR-6538)在感染后4h上调表达。感染后28h时,7种miRNA(miR-301a-3p、miR-1249-3p、miR-6538、miR-714、miR-19a-3p、miR-101c、miR-99b-5p)差异表达,其中只有miR-99b-5p下调表达,其余上调表达。相对于4h实验组,在28h实验组中PRV编码的miRNA,仅有prv-miR-LLT1的表达量显著上调。用stem-loop qRT-PCR方法验证了高通量测序结果的可靠性。差异表达miRNA靶基因GO分析结果表明,宿主miRNA调控的基因主要影响细胞组分、分子功能及生物学过程;Pathway分析结果显示宿主miRNA调控的基因主要参与磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(Akt)信号通路、促分裂素原活化蛋白激酶信号通路、神经信号传递通路、肌动蛋白细胞骨架调节通路、焦点粘连。用差异表达的宿主及病毒miRNA和病毒靶基因做基因网络图显示宿主及病毒生物miRNA可靶向多个病毒靶基因形成复杂的网络。同时根据测序数据预测到小鼠的多条miRNA,但仍需要实验进一步验证。上述的研究结果为进一步深入研究miRNA调控α疱疹病毒的嗜神经性,潜伏感染性及免疫逃避等奠定了基础。
[Abstract]:Pseudorabies virus (Pseudorabies virus PRV) is an important member of alpha herpesvirus, with nerve tropism and latent infection, causing huge economic losses to the pig industry. Virus infection of the host in the life history of herpes simplex virus and pathogen host miRNA interaction plays an important role in the present study. About PRV in vitro to use most of the PK-15 cells, and the research on nerve cells are rarely seen. The purpose of this study was to establish PRV infected cells (Neuro-2a cells) infection model and determination of miRNA expression, discuss the possible mechanism of pathogen interactions with host cells. PRV Neuro-2a cells infected by the CPE, TCID50 assay, PCR and indirect immunofluorescence assay, evaluated the proliferation of PRV in Neuro-2a. The results showed that after PRV infection, Neuro-2a caused typical cytopathic effect by TCID50; Was found with the passage of time, the virus titer gradually increased; PCR and indirect immunofluorescence test showed PRV proliferation in Neuro-2a. That the PRV can be adapted to Neuro-2a cells, it can be used to study PRV infection, latent infection and pathogenesis. The establishment of PRV detection IE180, EP0, fluorescence quantitative method the expression level of VP16 (qRT-PCR) and, for the detection of PRV were used to infect PK-15 cells and Neuro-2a cells (MOI=5) after 0h, 2h, 4h, 6h, IE180, EP0, the relative expression of VP16. The results showed that in two different cell PRV in IE180, EP0, VP16 expression trend differences, suggesting the presence of epithelial cells and infected by PRV nerve cell "strategy". The difference by Solexa sequencing technology and stem-loop qRT-PCR identification of PRV infected Neuro-2a cells. The expression profile of miRNA by Bioinformatics Method and PRV miRNA analysis of the host for the virus gene regulatory networks And the virus infection on host mi RNA expression. High throughput results show that 4H in the experimental group detected mi RNA PRV encoding a total of 7, respectively, prv-miR-LLT1, prv-miR-LLT2, prv-miR-LLT4, prv-miR-LLT5, prv-miR-LLT6, prv-miR-LLT10a, prv-miR-LLT10b. expression of these miRNA are low in.28h experimental group were detected in PRV encoding the miRNA is 10, 3 more than the 4H experimental group, respectively prv-miR-LLT3, prv-miR-LLT11a, 13 miRNA, PRV encoding prv-miR-LLT11b.28h in the experimental group the expression of miRNA encoding PRV released increased in.MiRBase database of prv-miR-LLT7, prv-miR-LLT8 and prv-miR-LLT9 were not expressed in 4H and 28h in the experimental group. By comparison PRV infected Neuro-2a cells, there are 4 kinds of host mi RNA (miR-146b-5p, miR-714, miR-466k, miR-6538) in the upregulation of 4H expression after infection. 28h after infection, 7 kinds of miRNA (miR-301a-3p, miR-1249-3p, miR -6538, miR-714, miR-19a-3p, miR-101c, miR-99b-5p) differential expression, the expression of only miR-99b-5p, the expression of 4H. Compared with the experimental group, the experimental group 28h PRV encoding miRNA, expression of prv-miR-LLT1 only increased significantly. By using stem-loop qRT-PCR method to verify the reliability of high-throughput sequencing results. The differential expression of miRNA target GO gene analysis showed that the host miRNA gene mainly affects the cellular component, molecular function and biological process; the Pathway analysis results showed that the host miRNA regulated genes mainly involved in phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K) protein serine threonine kinase (Akt) pathway, mitogen activated protein kinase pathway, nerve signal pathway, regulation of actin cytoskeleton and focal adhesion pathway. The host miRNA and viral target genes with differential expression gene network Show host and virus biological miRNA targeting multiple viral target genes form a complex network. At the same time according to the sequencing data to predict multiple miRNA mice, but still need to be validated by experiments. The results of the study for further study on the regulation of miRNA alpha herpes virus tropism by God, and laid the foundation of latent infection immune escape.

【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

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