猪环磷酸鸟苷—腺苷酸合成酶cGAS基因的克隆及其功能鉴定
发布时间：2018-03-17 19:50
本文选题：猪 切入点：cGAS 出处：《河南农业大学》2015年硕士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：环鸟苷-腺苷酸合成酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase,cGAS)属于核苷酸转移酶家族的成员,可以识别胞质DNA,并通过合成第二信使环磷酸鸟苷-腺苷(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate,cGAMP)介导I型干扰素的产生,启动机体的先天性免疫反应。虽然在人和鼠的细胞中cGAS作为一种DNA识别受体,可以识别细胞质DNA,催化cGAMP合成,并通过STING(stimulator of interferon genes)依赖的方式活化转录因子IRF3,促进IFN-β的表达。但猪的cGAS是否也可作为细胞质DNA感受器而触发I型干扰素的产生并未见报道。为了对猪cGAS基因进行功能鉴定,本研究通过RT-PCR的方法从猪脾脏组织中克隆了cGAS基因片段,对cGAS基因进行分析,进行了组织表达谱分析和系统进化分析,并将该片段与pEGFP-N1和p3×Flag-CMV-10载体进行连接,构建p-cGAS-EGFP和Flag-cGAS载体,然后转染PK15细胞,在细胞水平上对p-cGAS进行亚细胞定位,检测p-cGAS的表达情况和对IFN-β表达的影响。通过慢病毒介导的RNA干扰技术对p-cGAS在PRV或poly(dA:dT)/p-cGAS/STING和IRF3/IFN-β通路上进行先天性免疫方面的功能鉴定。结果表明,克隆的猪cGAS的编码序列长度为1494 bp,编码497个氨基酸,蛋白质分子量为56 kDa,等电点为9.56,其蛋白内部有一个Mab-21结构域,并有四个催化中心活性位点。氨基酸序列与牛的相似性最高,为74%。组织表达谱分析的结果显示,在脾脏,十二指肠,空肠,回肠几个组织表达量较高,在心、肝等组织中表达量较低。细胞亚定位的结果显示,猪cGAS主要定位于内质网膜。过表达猪cGAS可以通过STING和IRF3依赖的方式促进IFN-β的表达,。RNA干扰下调PK15细胞p-cGAS后,感染PRV或转染poly(dA:dT),都可使IFN-β的表达量明显降低。这些结果显示,猪cGAS在PRV和dsDNA诱导的IFN-β表达过程中发挥重要作用。
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本文编号：1626240
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