狂犬病病毒磷蛋白重组人5型腺病毒的构建及生物学特性的初步研究

发布时间：2018-03-19 00:27

本文选题：狂犬病病毒　切入点：磷蛋白　出处：《吉林农业大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：狂犬病病毒(rabies virus,RABV)属于单负病毒目(Mononegavirals)弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)成员,感染机体后引起一种以脑脊髓炎为主要临床症状的致死率极高的神经性疾病(狂犬病)。该病毒感染包括人类在内的大多数哺乳动物,一旦出现临床神经症状,致死率达100%。随着分子生物学技术的发展,对RABV致病机理的深入研究发现,构成该病毒基因组的结构蛋白成分在病毒感染、复制过程中发挥着极为重要的作用,其中RABV磷蛋白(phosphoprotein,P)可与宿主细胞一些蛋白成分相互作用形成复合物,揭示了P蛋白可在宿主与病毒相互作用过程中发挥多种功能。例如能够阻止干扰素调节因子3(interferon regulatory fator,IRF3)的激活,从而阻止干扰素α/β的表达,进而逃逸宿主细胞的固有免疫。我们前期实验已经在细胞水平上证实了RABV强毒株BD06株和弱毒株SRV9株P蛋白对RIG-I依赖的干扰素通路均有一定的抑制作用,而P蛋白在体内对RIG-I依赖的干扰素通路是否有抑制作用,需要将P蛋白基因导入体内进行研究。对P蛋白功能的研究需基于该蛋白的独立表达,以避免RABV其他结构蛋白表达对其功能的影响。P蛋白的独立表达需要一种有效的真核表达载体介导。腺病毒载体作为一种常用的真核表达载体,其基因组大小适中,具有一定的外源基因承载能力,可介导外源基因高效表达,制备高滴度病毒容易,表达的重组靶蛋白接近天然蛋白的生物学功能,且具有良好的生物活性,因此是阐明蛋白功能的有力工具。基于以上考虑,本研究拟选用复制缺陷型人5型腺病毒表达系统,分别构建RABV强毒株(BD06株)与弱毒株(SRV9株)P蛋白的重组人5型腺病毒,为进一步比较强弱毒株P蛋白对机体固有免疫的影响。我们分别将狂犬病病毒强毒株(BD06株)与弱毒株(SRV9株)完整的P蛋白基因编码区克隆入腺病毒表达系统穿梭质粒,获得重组穿梭质粒pacAd5-BD06-P和pacAd5-SRV9-P。重组穿梭质粒和骨架质粒被限制性内切酶PacI线性化后,共转染HEK293AD细胞,经同源重组并包装出携带RABV-P基因的重组腺病毒rAd5-BD06-P和rAd5-SRV9-P。待病毒增殖稳定后,从病毒培养液上清中PCR扩增得到894bp大小的目的条带,证明目的基因P蛋白已重组到腺病毒基因组中;取重组病毒培养物经2%磷钨酸负染,于透射电镜下可观察到腺病毒粒子的典型特征。利用P蛋白基因全长扩增引物对重组腺病毒感染的HEK293AD细胞进行RT-PCR扩增均得到了894bp大小的目的条带,证实P蛋白基因可被腺病毒介导在HEK293AD细胞的转录;以FITC标记的抗P蛋白单克隆抗体对2株重组腺病毒感染的复制型细胞系和非复制型细胞系进行直接免疫荧光检测,荧光显微镜下均可见特异性荧光,结果表明P蛋白可在复制型细胞系和非复制型细胞系中表达;以抗P蛋白的单克隆抗体对2株重组腺病毒感染的HEK293AD细胞中的细胞总蛋白进行Western-blot检测,结果显示均出现了约40kDa的特异性条带,这也从蛋白水平上证实了P蛋白在感染细胞中表达。增殖稳定的重组腺病毒滴度均可达107.5TCID50/ml以上,且一步增殖试验结果显示外源基因的插入对病毒的增殖影响不明显。为进一步评价P蛋白基因在小鼠体内的表达特性,将2×106.5TCID50的重组腺病毒rAd5-BD06-P和rAd5-SRV9-P腹腔接种小鼠(每组4只),分别于接种前及接种14d后尾静脉采血,分离血清,300~500倍稀释作为待检样品,RABV作为抗原,利用间接免疫荧光试验检测接种重组病毒后的小鼠血清中是否存在针对RABV P蛋白抗体及反应活性。结果显示,重组腺病毒rAd5-BD06-P和rAd5-SRV9-P能有效感染小鼠,介导P基因在小鼠体内的表达,并能刺激机体产生针对RABV P蛋白抗体,且与RABV有良好的反应活性。综上所述,本研究成功构建了表达狂犬病病毒BD06株和SRV9株P蛋白复制缺陷型重组人5型腺病毒,重组腺病毒表达的P蛋白在感染细胞和小鼠体内均呈现良好的抗原反应性和免疫原性,为进一步研究P蛋白在病毒感染过程中的作用奠定了基础。
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【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

【参考文献】