猪星状病毒RT-PCR检测方法的建立及两株江西地区猪星状病毒全基因组测序与分析

发布时间：2018-03-20 03:12

本文选题：星状病毒　切入点：RT-PCR　出处：《江西农业大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：星状病毒(Astrovirus)被认为是引起婴幼儿、老年人及抵抗力缺陷人群病毒性腹泻的第二大病原。星状病毒广泛分布于世界各地,可感染人、多种哺乳动物和禽类,其基因组变异性较大,适应宿主能力强。有研究表明星状病毒存在不同血清型和不同种间的基因重组,并可能存在动物之间和动物与人之间的跨种传播。星状病毒的宿主适应性、衣壳蛋白变异性、基因重组性使得其具有潜在的公共卫生学危险。猪星状病毒(Porcine Astrovirus,PAst V)可与轮状病毒、猪流行性腹泻病毒等肠道病原混合感染引起仔猪腹泻,造成巨大的经济损失。本研究根据Gen Bank登录的PAst VRNA依赖型RNA多聚酶(RDRP)基因的保守区域设计引物,建立并优化了一种快速高效的反转录多聚酶链式反应检测方法(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR),将扩增出的片段命名为H片段。然后,将H片段克隆至p MD18-T载体构建重组质粒标准品用于敏感性检测。敏感性检测结果表明本研究建立的RT-PCR方法能检测到的最低模板拷贝浓度为103copies/μl。应用该检测方法对从江西地区10个商业猪场采集的共219份仔猪粪便和肠组织样品进行了检测,检测结果表明PAst V在粪便样品的阳性率为29.2%(47/161),在肠组织样品的阳性率为51.7%(30/58)。从样品采集时间来看,1月份的样品阳性率最高为66.7%,3月份最低为18.7%。为研究江西地区猪星状病毒的遗传变异和分子流行病学,本研究首先对Gen Bank目前登录的12条PAst V全长序列进行了比对分析,在此基础上设计了5对特异性引物,对两株分别采集自江西吉安和江西樟树的PAst VJXJA株和JXZS株的基因组进行全长扩增,另外设计了2条RACE引物对c NDA末端进行扩增,将扩增的片段连接至p MD18-T载体并克隆测序。使用DNASTAR的Editseq和Mega Align等软件将得到的各片段序列进行编辑和装配,最终得到JXJA株全长为6675nt,JXZS株全长为6700nt。对这两株病毒基因进行同源性分析,发现这两株病毒全基因核苷酸和氨基酸同源性分别为82.2%和66.3%,ORF1a同源性分别为94.9%和97.6%,ORF2同源性分别为62.6%和49.9%。本研究使用MEGA 6.0软件对JXJA株、JXZS株和Gen Bank上登录的其它30株哺乳动物和禽类星状病毒参考株的全基因序列做遗传进化分析,对JXJA株、JXZS株和其他11株PAst V的全基因、ORF1a基因、ORF2基因分别做了遗传进化分析。全基因组进化树分析结果表明猪星状病毒JXJA株和JXZS株与猪星状病毒4型遗传距离最近,与鼠星状病毒较近,存在重组的可能,与人星状病毒较远,重组可能性较低。此外,ORF2的进化结果表明,JXZS株与JXJA株以及其他2株4型PAst V包括野猪星状病毒匈牙利株处于进化树不同分支,基于星状病毒依据ORF2基因型分型的原则,JXZS株可能为一株新型的猪星状病毒。本研究建立了一种针对PAst V的RT-PCR检测方法,将该方法用于江西商业猪场的PAst V感染率检测,结果表明江西地区猪群PAst V感染普遍,冬季较高。与此同时,本研究对两株江西地区PAst V的全基因序列进行了分析,分析结果揭示了江西地区PAst V的遗传和变异关系,本研究的测序株与目前国内报道的仅有的1株上海株和1株广西株基因组差异大,提示与这两株PAst V可能属于不同的血清型。研究结果为PAst V的研究提供了更多的参考依据,为PAst V的诊断和防控提供了理论基础和方法。
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【学位授予单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

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