小反刍兽疫间接ELISA抗体检测方法建立与初步应用

发布时间：2018-03-22 03:35

本文选题：小反刍兽疫　切入点：N蛋白　出处：《吉林农业大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：小反刍兽疫(Peste des petits of ruminants)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits of ruminants virus,PPRV)引起绵羊、山羊等的一种急性传染病,临床上以发热、眼睛和鼻脓性分泌物、坏死性和糜烂性口腔炎、胃肠炎、腹泻、呼吸困难、支气管肺炎等为特征,发病率和死亡率极高,具有高度传染性,被OIE列为A类疫病。该病1942年首次暴发于象牙海岸(即科特迪瓦),随后蔓延至西非、中非、阿拉伯半岛及南亚次大陆地区,呈现由西向东蔓延的趋势,甚至向欧洲传播,给全球畜牧业经济带来极大威胁。我国2007年7月在西藏自治区日土县首次发现PPR疫情,此后在全国范围内普遍出现PPR疫情,疫情传播快、跨度大、风险高,给我国畜牧业造成严重损失,但疫情起源不明确。针对PPR,扑杀和疫苗接种是预防该病的主要手段,免疫效果的好坏是评价和控制疫情的一个重要指标。因此,通过建立一种PPRV间接ELISA抗体检测方法,检测抗体水平高低来评价免疫防控效果,达到免疫监测的目的。小反刍兽疫病毒(Peste des petits of ruminants virus,PPRV)是一种不分节段的单股负链RNA病毒,属于副黏病毒科(Paramyxoviridae),麻疹病毒属(Morbolivirus)。PPRV基因组全长15948nt,编码核蛋白(N)、血凝素蛋白(H)、磷蛋白(P)、融合蛋白(F)、基质蛋白(M)和大多聚酶蛋白(L),及两种非结构蛋白C和V。其中N基因全长1578bp,具有高度保守性。麻疹病毒属N蛋白序列相似性达67%-74%,N蛋白是病毒转录和复制的主要结构蛋白;N蛋白在PPRV中是含量最高、免疫原性最强的蛋白,其抗原性稳定;在PPRV感染的动物血清中针对N蛋白的抗体占很高成分,但不具有中和作用。同时,该蛋白还含有T细胞抗原表位,能诱导机体产生特异性细胞免疫反应。因此,N蛋白是建立PPRV抗体检测方法的理想候选抗原,可以利用N蛋白对羊群等动物群中PPRV抗体水平进行监测,从而进行大范围的免疫监测。本研究拟以N蛋白作为包被抗原,通过建立检测PPRV抗体的间接ELISA方法,为研制PPR免疫抗体监测试剂盒奠定基础。研究首先采用人工合成PPRV N蛋白基因序列构建了重组质粒pSumo-mut-N,经EcoR I/Xho I双酶切和测序证明构建成功后,将重组质粒pSumo-mut-N转化至大肠杆菌Arctic Express中,获得表达菌N-Arctic Express。经条件优化,确定N蛋白最优表达条件为在0.5mM IPTG诱导,11℃时震荡培养10h。N蛋白表达量为120μg/ml。经SDS-PAGE和Western blot分析显示,重组蛋白相对分子质量约71.9kDa,与PRRV羊阳性血清具有良好的反应原性。采用Ni柱亲和层析对表达的N蛋白进行纯化,以该纯化的N蛋白为包被抗原,以已知PRRV羊阴、阳性血清进行检测条件的优化,建立了PPRV间接ELISA抗体检测方法。确定间接ELISA建立的程序为:(1)抗原包被:酶联板抗原包被量0.24ug/孔,100μl/孔,37℃包被2h;(2)封闭:加入5%脱脂奶粉于37℃封闭1.5h,200μl/孔;(3)与待检血清样品反应:加入用PBST作1:40倍稀释的血清,100μl/孔,37℃孵育50min;(4)与二抗反应:加入1:5000倍稀释的HRP标记的兔抗羊Ig G,100μl/孔,37℃孵育1h;(5)显色:加入TMB,100μl/孔,37℃避光显色15min;(6)终止:加入2M H2SO4终止反应,50μl/孔,酶标仪读取OD450值。通过中和试验确定屠宰场采集的15份羊血清、免疫PPRV细胞毒的两只健康羊采集血清的阴、阳性。根据上述确定的间接ELISA最佳程序对屠宰场采集的15份已知阴、阳性羊血清、免疫PPRV细胞毒的两只健康羊采集血清、某地患病羊群采集的11份血清、开封疾控中心采集馈赠的31份临床样品血清(为已知血清,经竞争ELISA检测为全阴性)进行检测。根据统计学方法计算阴性血清OD450的平均值X=0.470,标准差SD=0.16594,根据公式X±3SD计算血清样品阴、阳性临界值及其判定标准。经计算X±3SD=0.968,确定待检血清OD450值≥0.968为阳性,待检血清OD450值㩳0.968为阴性。对上述羊血清样品利用ROC曲线评估此间接ELISA方法,其ROC曲线的AUC=1,说明此间接ELISA方法应用价值较高,且其敏感性和特异性均为100%。同时,批间和批内重复性试验结果均表明此方法具有较好的稳定性和重复性。针对上述31份临床样品血清的间接ELISA检测结果与血清提供单位的竞争ELISA检测结果完全一致,均为阴性,符合率为100%。综上,本研究成功构建了PPRV N蛋白原核表达重组菌,诱导表达了N蛋白;利用该蛋白确定了PPRV间接ELISA抗体检测方法的最佳程序。对临床血清样品的检测结果显示,其ROC曲线的AUC=1,说明其应用价值较高,为PPRV间接ELISA抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。
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【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S855.3

【参考文献】