表观遗传学修饰对新孢子虫感染的小鼠巨噬细胞IL-12延迟表达的调控

发布时间：2018-03-23 06:03

本文选题：新孢子虫　切入点：巨噬细胞　出处：《吉林大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：新孢子虫病是由犬新孢子虫寄生于宿主细胞内所引起的一种多种动物共患的原虫病,临床上可引起怀孕母畜流产、产死胎、弱胎;还可引起新生幼畜的先天性神经系统和运动障碍性疾病。该病分布范围广,感染率高,对养殖业造成了巨大的经济损失。目前,由于新孢子虫生活史尚不清楚,尚无有效防治新孢子虫的药物和疫苗。新孢子虫感染宿主细胞后,首先会被DC细胞和巨噬细胞等抗原提呈细胞所识别,进行抗原的捕获和呈递。其中,巨噬细胞在机体对外来病原清除的过程中,既可以通过抗原提呈作用来激活T细胞,还可以通过分泌IL-12等细胞因子激活Th1细胞,介导Th1类型的免疫应答反应,是一种在抵抗新孢子虫感染过程中起着十分关键作用的免疫细胞。但是,由于巨噬细胞也属于有核细胞,因此新孢子虫也会将巨噬细胞作为寄生的宿主细胞之一。在机体抵抗新孢子虫感染的过程中,巨噬细胞不仅可以捕获和提呈抗原,还可以分泌多种促炎性细胞因子来辅助机体进行免疫应答。IL-12是一种主要由巨噬细胞,DC细胞等APC细胞分泌,参与机体早期免疫应答的促炎性细胞因子,对于介导寄生于细胞内的病原微生物所引起的细胞免疫应答有着十分重要的作用。IL-12可以促进NK细胞活化分泌IFN-γ。研究表明,IL-12和IFN-γ在参与宿主抵抗新孢子虫免疫应答反应的同时,还可以激活氧自由基和一氧化氮等代谢产物,与其共同作用直接杀死新孢子虫。但是,寄生虫为了能在宿主体内生存,形成了一套逃避宿主免疫保护反应的能力,称为免疫逃避。其中抑制细胞因子分泌是寄生虫免疫逃避的方式之一。研究发现,弓形虫可以通过抑制IL-12的分泌在感染早期逃避宿主的免疫应答;mi RNA和组蛋白修饰等表观遗传学修饰对于调控IL-12基因的表达具有一定影响。但是目前,新孢子虫感染引起宿主细胞IL-12分泌变化的规律和调控IL-12分泌的表观遗传学修饰机制尚不清楚。本研究通过新孢子虫感染巨噬细胞引起IL-12的动态变化、mi RNAs和组蛋白修饰对IL-12分泌的调控等研究,阐明了表观遗传学修饰对新孢子虫感染的巨噬细胞IL-12表达的影响。新孢子虫感染巨噬细胞引起IL-12的动态变化通过密度梯度离心的方式纯化新孢子虫速殖子,用来感染小鼠腹腔分离的原代巨噬细胞。收集感染后6h、12h、18h、24h、36h的细胞上清,检测IL-12的表达情况。结果显示,在6h时可以检测到IL-12的表达,但是在18h内,IL-12均处于较低的表达水平。24h检测到IL-12的表达量开始升高,36h时IL-12的表达量进一步升高。表明新孢子虫在感染小鼠巨噬细胞后,会在前18h抑制巨噬细胞IL-12的表达。新孢子虫感染的巨噬细胞mi RNA对IL-12的调控使用新孢子虫感染小鼠腹腔巨噬细胞,提取感染后6h、12h、18h、24h、36h巨噬细胞的总RNA,进行反转录,用Real time PCR的方法对与IL-12分泌相关的六种mi RNA(mi R-221、mi R-155、mi R-146a、mi R-10a、mi R-21、mi R-187)的动态变化进行检测,结果发现mi R-187的变化趋势与IL-12分泌的变化趋势一致,其余mi RNA均未发现具有明显意义的变化趋势。之后,用新孢子虫感染转染了mi R-187激动剂与抑制剂的巨噬细胞,收集6h、12h、18h、24h、36h的细胞上清,检测IL-12的表达情况。结果显示转染了mi R-187激动剂的巨噬细胞,IL-12的表达量具有一定程度的上升,而转染了mi R-187抑制剂的巨噬细胞,IL-12的表达量略有下降。表明mi R-187在新孢子虫感染的巨噬细胞中,可以促进IL-12的表达。对mi R-187可能作用的靶标基因进了预测,使用双荧光素酶报告基因系统检测重组载体Luc基因表达的变化。结果表明在共转染了mi R-187和含有靶标基因重组载体的试验组中,Luc2的表达率明显下降,而在共转染了mi R-187和含有突变靶标基因重组载体的试验组中,Luc2的表达率没有变化。表明mi R-187可以和预测的靶标基因相互作用,阻碍Luc2基因的表达。新孢子虫感染的巨噬细胞IL-12启动子区的组蛋白修饰收集新孢子虫感染后18h的巨噬细胞,使用H3K27me2、H3K4me3、H3K9/K14ac抗体进行Ch IP试验,使用Real time PCR对IL-12p40启动子区和IL-12p35启动子区的启动子变化进行检测。结果显示,在H3K27me2试验组中,IL-12p40启动子区的启动子数量明显上升,但在其余位点均未发现明显变化。表明新孢子虫感染巨噬细胞后,可以通过改变H3K27me2的变化来调控IL-12p40的表达。综上所述,本研究,发现了新孢子虫感染小鼠巨噬细胞后,可延迟IL-12的表达并引起4种相关mi RNAs的表达呈现不同的动态变化,其中mi R-187对新孢子虫感染后的巨噬细胞IL-12表达具有一定影响。表明新孢子虫可以通过抑制mi R-187的表达和调节IL-12p40启动子区组蛋白H3K27me2修饰的方式降低小鼠巨噬细胞IL-12的表达。从表观遗传学角度解析了新孢子虫在感染早期,通过延迟IL-12分泌从而有助于其建立感染的免疫逃避机制。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.723

【参考文献】