猪成纤维细胞重编程和可溶性猪源SOX2-11R重组蛋白制备

发布时间：2018-03-23 06:33

  本文选题：成纤维细胞　切入点：体细胞核移植　出处：《安徽农业大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：体细胞核移植(somatic cells nuclear transfer,SCNT)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)和基因编辑等技术的突破与完善,为医学、畜牧业和生物学基础研究等带来了新的曙光。作为一种重要的经济动物,猪在解剖学、生理学等方面比小鼠更接近于人类,正逐渐成为人类异种移植和再生医学研究中理想的生物学模型。自SCNT和i PSCs取得成功以来,它们在猪上均有较大发展,但SCNT还存在效率低和克隆后代死亡率高等问题,而猪iPSCs也存在基因整合等安全性问题。其中,源头细胞作为两种重编程技术中的首个关键步骤,适宜的源头细胞可能为解决重编程中效率和安全等关键问题提供思路。本研究首先建立了猪胚胎成纤维细胞系(porcine embryonic fibroblasts,PEFs)和成年猪耳源成纤维细胞系(adult porcine ear fibroblasts,APEFs);并以PEFs、APEFs、仔猪脂肪干细胞系(adipose-derived stem cells,ADSCs)为供体细胞进行SCNT,探讨对重构胚胎发育能力的影响;其次,利用多西环素(DOX)诱导的慢病毒系统将PEFs、APEFs和ADSCs重编程为iPSCs,并对各自的重编程效率进行对比分析。旨在借助SCNT和i PSCs两种经典的细胞重编程方法,综合考虑各因素,优选出供体细胞及其重编程方案;最后,通过原核表达的方法制备具有穿透细胞膜功能的可溶性的EGFP-11R和SOX2-11R重组蛋白,以期为制备其它重组蛋白和以蛋白诱导获取无基因整合的iPSCs奠定基础。具体试验及结果如下:试验一成纤维细胞建系和SCNT——通过酶消化、倒置贴壁培养和尼龙网过滤等方法,本实验室成功构建了PEFs,APEFs和ADSCs三株细胞系。在取材方面,因APEFs来自成年公猪耳缘皮肤组织,取材方便、成本低,在动物良种资源保护上具有很大的实际应用价值;ADSCs取自于仔猪背部皮下组织,操作复杂;而PEFs取自于健康怀孕母猪的胎儿,取材和操作繁琐、成本高。在增殖和细胞状态方面,发现增殖数率由高到低依次为ADSCs,PEFs和APEFs;ADSCs和PEFs折光性好、形态饱满,APEFs状态则略差。在作为供体细胞支持重构胚发育方面,以囊胚率做为指标,发现ADSCs和PEFs显著高于APEFs(P0.05)。在重构胚质量方面,以囊胚总细胞数为指标,发现PEFs源重构胚的质量显著优于APEFs(P0.05)。试验二成纤维细胞与ADSCs源猪iPSCs建系——通过DOX诱导的慢病毒系统,成功使三种细胞发生了重编程过程,且都能观察到AP阳性克隆。通过对接种细胞数和克隆总数的统计分析,发现猪ADSCs的重编程效率高于其它两株成纤维细胞系,与SCNT结果一致。在PEFs源i PSCs的建立过程中,先后观察到两类克隆,这证明重编程是一个逐渐缓慢的过程,持续的单克隆传代可能有利于重编程程度的提高。PEFs源iPSCs表现为AP阳性,且在体外培养时无需额外添加药物DOX;在mRNA水平上,外源性OCT4,SOX2,KLF4和C-MYC表达显著高于源头细胞,且内源性OCT4,SOX2,KLF4和C-MYC也得到了激活,OCT4和SOX2表现尤为明显。在蛋白水平上,该株iPSCs表达OCT4和NANOG蛋白。在分化潜能方面,体外能形成拟胚体,形成效率在3%左右。通过逆转录PCR发现,外源性基因OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC已整合到细胞基因组。试验三可溶性EGFP-11R和SOX2-11R重组蛋白的制备——依次通过载体构建、蛋白表达条件摸索和纯化、蛋白鉴定与转导入细胞等步骤,在大肠杆菌提取物的上清中成功获取且纯化出了EGFP-11R和SOX2-11R重组蛋白,且验证其都具有穿透细胞膜能力。其中,可溶性EGFP-11R重组蛋白的最佳表达条件为37℃和0.5 mol/L IPTG诱导4h,而可溶性SOX2-11R重组蛋白的最佳表达条件为28℃和0.5 mol/L IPTG诱导4h。综上所述,本研究首先建立了PEFs和APEFs细胞系,发现APEFs在取材、建细胞系成本、动物福利和良种资源保护方面要优于PEFs和ADSCs。然后,同ADSCs一起对三者的重构胚胎发育能力进行检测,发现在以囊胚率为指标的重构胚发育方面ADSCs和PEFs要优于APEFs,在囊胚质量方面,发现PEFs源囊胚的总细胞数要高于APEFs源囊胚。此外,利用iPSCs技术对三种细胞的重编程潜能进行了再次检测,发现ADSCs显著高于PEFs和APEFs,而PEFs和APEFs间差异不显著,这与SCNT的结果相符;然而,建立的PEFs源iPSCs存在基因整合,限制了其进一步应用。最后,利用原核表达系统制备了在上清中表达且纯化、具有穿透细胞膜功能的EGFP-11R重组蛋白和SOX2-11R重组蛋白,为利用蛋白制备无基因整合的猪iPSCs奠定了基础。
[Abstract]:Somatic cell nuclear transfer (somatic cells nuclear transfer, SCNT), induced pluripotent stem cells (induced pluripotent stem cells, iPSCs) and perfect, and gene editing techniques for a breakthrough in medicine, animal husbandry and biological basic research has brought a new dawn. As an important economic animal, pig in anatomy and physiology on closer than mice to humans, is becoming a biological model of transplantation of human xenograft and regenerative medicine ideal. Since SCNT and I PSCs to succeed, they have made great progress in swine, but SCNT also has low efficiency and high mortality of cloned offspring, and pig iPSCs has gene integrated security the problem. Among them, the source of cells as the two reprogramming in the first key step, the source of cells may provide suitable ideas for solving the key problem of efficiency and safety of reprogramming. This study established a porcine fetal fibroblast cell line (porcine embryonic, fibroblasts, PEFs) and adult pig ear fibroblast cell line (adult porcine ear fibroblasts, APEFs); and PEFs, APEFs, pig fat stem cell line (adipose-derived stem cells, ADSCs SCNT) as the donor cells, to explore the influence of the ability the reconstruction of embryonic development; secondly, the use of doxycycline (DOX) lentiviral system induced by PEFs, APEFs and ADSCs programming is iPSCs, and the reprogramming efficiency were analyzed. By means of a cell reprogramming method to SCNT and I PSCs two classic, comprehensive consideration of various factors, selected donor cells and reprogramming scheme; finally, through the method of preparation of prokaryotic expression of soluble cell membrane penetration function of EGFP-11R and SOX2-11R recombinant protein, in order for the preparation of other heavy group protein and protein induced by free access Lay the foundation for the integration of iPSCs gene. The specific test and the results are as follows: 10% test of fiber cell line and SCNT by enzyme digestion, inverted adherent and nylon mesh filter method, we successfully constructed PEFs, APEFs and ADSCs three cell lines. In terms of materials, because of APEFs from adult boar ear skin organization, convenient, low cost, has great practical value in animal breeding resources protection; ADSCs is taken from the subcutaneous tissue of piglets, complex operation; while PEFs from healthy pregnant sows were fetal, and the operation is complicated, the cost is high. The proliferation and cell state, found that proliferation rate is high to low is ADSCs, PEFs and APEFs; ADSCs and PEFs with good refraction, plump shape, APEFs is slightly worse. As donor cells support the development of reconstructed embryos, as the index to the blastocyst rate, ADSCs and PEFs were found Higher than APEFs (P0.05). The quality of reconstructed embryos, the total cell number of blastocyst as index, PEFs found the source of the reconstructed embryo quality was significantly better than that of APEFs (P0.05). The lentivirus system test 20% cells and ADSCs swine iPSCs lines, induced by DOX, the success of the three cell reprogramming process, and can be observed in AP positive clones. The total number of clones and through statistical analysis found that pigs inoculated cells, ADSCs reprogramming efficiency is higher than that of the other two strains of fibroblast cell lines, consistent with the SCNT results. In the process of building the PEFs source I PSCs, has observed two types of clones, which proved heavy programming is a gradual process, continuous passage may help monoclonal reprogramming to improve the degree of.PEFs source iPSCs showed AP positive, and no need of additional drug DOX in vitro; at the level of mRNA, exogenous OCT4, SOX2, KLF4 and C-MYC The source was significantly higher than in cells, and endogenous OCT4, SOX2, KLF4 and C-MYC have also been activated, OCT4 and SOX2 is obvious. At the protein level, the expression of OCT4 and NANOG protein in the strain iPSCs. The differentiation potential in vitro, to form embryoid bodies, the formation efficiency of around 3%. Found through reverse transcription PCR exogenous gene, OCT4, SOX2, KLF4 and C-MYC had been integrated into the cell genome. Test three soluble EGFP-11R and SOX2-11R recombinant protein preparation, followed by protein expression vector, and explore the conditions of purification, and turn into the cell steps of protein identification, in Escherichia coli extracts was successfully obtained and purified EGFP-11R and the recombinant protein SOX2-11R, and verify it has to penetrate the cell membrane. The soluble recombinant EGFP-11R protein of the optimal expression conditions of 37 DEG C and 0.5 mol/L IPTG induced by 4h, and the soluble recombinant protein SOX2-11R White the optimal expression conditions of 28 DEG C and 0.5 mol/L IPTG induced by 4h. in this study, we established a PEFs and APEFs cell lines were found in the APEFs cell line, construction cost, animal welfare and seed resource protection is superior to the PEFs and then ADSCs., together with ADSCs of the three reconstructed embryos developmental ability test in ADSCs and PEFs, that is better than APEFs for the development of reconstructed embryos to blastocyst rate index, the quality of blastocysts, found that the total number of cells in blastocysts was higher than that of PEFs source APEFs source blastocysts. In addition, the use of iPSCs technology on the three cell reprogramming potential were detected again, found that ADSCs was significantly higher than that of PEFs and APEFs however, no significant difference between PEFs and APEFs, which is consistent with the results of SCNT; however, the establishment of the PEFs source iPSCs gene integration, limiting its further application. Finally, the expression system was prepared in the supernatant by prokaryotic The recombinant protein and SOX2-11R recombinant protein, which express and purify the cell membrane function, have laid the foundation for the preparation of gene free porcine iPSCs with EGFP-11R.

【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S828

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 肖雄;邓玉金;李跃民;;哺乳动物体细胞重编程机制的研究进展[J];中国畜牧杂志;2013年09期

2 郝振华;伊璐;郝称莉;翟明霞;刘红林;;哺乳动物细胞核重编程方法学研究进展[J];畜牧与兽医;2007年12期

3 张力;韩树标;李跃民;;动物体细胞核移植后核重编程可能的机制[J];湖北畜牧兽医;2007年04期

4 张利生,陈大元;克隆动物发育过程中基因组的重编程[J];生物化学与生物物理进展;2002年06期

5 陈洁;李冬杰;贾慧;李世杰;;表观重编程与体细胞克隆动物异常[J];安徽农业科学;2008年13期

6 王开云;陈丽文;刘德武;吴珍芳;;体细胞重编程为诱导多能干细胞的研究进展[J];中国畜牧兽医;2010年11期

7 ;Cell Res:高效诱导体细胞重编程新方法[J];广东农业科学;2010年07期

8 包阿东;苏志芳;陆涛峰;马惠茹;汪长寿;;miRNA对干细胞重编程的影响[J];中国畜牧兽医;2012年03期

9 沈彦军;杨福合;杜卫华;朱化彬;郝海生;;哺乳动物体细胞核移植的DNA甲基化重编程研究进展[J];动物医学进展;2009年04期

10 彭礼繁;罗光彬;;供体细胞核在小鼠重构胚胎重编程中的变化[J];广东畜牧兽医科技;2008年06期

相关会议论文 前10条

1 潘传英;蓝贤勇;陈宏;Colin E Bishop;;利用特定因子诱导293T细胞的重编程研究[A];第十二次全国畜禽遗传标记研讨会论文集[C];2010年

2 李劲松;;细胞重编程和胚胎发育[A];细胞—生命的基础——中国细胞生物学学会2013年全国学术大会·武汉论文摘要集[C];2013年

3 周琪;;体细胞重编程,挑战与希望[A];细胞—生命的基础——中国细胞生物学学会2013年全国学术大会·武汉论文摘要集[C];2013年

4 王二耀;于洋;焦丽红;王柳;周琪;;不同遗传背景的小鼠卵母细胞去核后重编程能力的研究[A];第十届全国生殖生物学学术研讨会论文摘要集[C];2005年

5 范宗兴;余大为;郝海生;赵学明;王栋;刘岩;秦彤;朱化彬;杜卫华;;爪蟾卵母细胞抽提物诱导体细胞重编程研究[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十六届学术研讨会论文集[C];2012年

6 高绍荣;;体细胞重编程研究进展[A];2012年中国科协海峡两岸青年科学家学术活动月——第九届海峡两岸细胞生物学学术研讨会论文集[C];2012年

7 杨柳;AL-KAL Abakar;蒋和生;;体细胞核移植技术中核重编程机制进展概述[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集（上册）[C];2010年

8 裴端卿;;Jhdm1a/1b以维生素C依赖性提高重编程效率[A];2012年中国科协海峡两岸青年科学家学术活动月——第九届海峡两岸细胞生物学学术研讨会论文集[C];2012年

9 赵宏喜;王莉;朱亚静;姜锋;李扬;张健;姚元庆;李凌松;;克服干细胞移植免疫排斥及iPS细胞重编程机制的初步研究[A];2012全国发育生物学大会摘要集[C];2012年

10 潘传英;卢柏松;陈宏;Colin E Bishop;;利用HIV-1 TAT融合表达4个转录因子蛋白重编程人的成纤维细胞[A];中国动物遗传育种研究进展——第十五次全国动物遗传育种学术讨论会论文集[C];2009年

相关重要报纸文章 前10条

1 谭薇　编译;细胞重编程助力干细胞研发[N];第一财经日报;2009年

2 记者 胡德荣;高效诱导体细胞重编程有新法[N];健康报;2010年

3 胡德荣;体细胞重编程分子机制研究获突破[N];中国医药报;2004年

4 岳阳;我学者发现改良iPS细胞的重要因子[N];中国医药报;2012年

5 记者 胡德荣;重编程异常细胞是“麻烦”制造者[N];健康报;2011年

6 胡德荣;体细胞重编程研究有新发现[N];健康报;2004年

7 胡德荣;羊水细胞能高效快速重编程为诱导多能干细胞[N];中国医药报;2009年

8 张梦然;生物体内环境同样适合细胞重新编程[N];科技日报;2013年

9 记者胡德荣;我国科学家培育出猪“万能”干细胞[N];健康报;2009年

10 赵永新;我科学家培育出世界首个猪干细胞[N];保健时报;2009年

相关博士学位论文 前10条

1 陈嘉瑜;Tet1对诱导型重编程的影响及非整合型hiPSC诱导的研究[D];北京协和医学院;2013年

2 高亚威;DNA羟甲基化酶Tet1促进体细胞重编程机制的研究[D];北京协和医学院;2013年

3 刘宇辰;重编程的CRISPR-Cas9对HPV6/11 E7基因转化细胞增殖与凋亡的影响及其机制研究[D];安徽医科大学;2015年

4 裴杨莉;Rab32通过促进脂类合成提高小鼠iPSCs的诱导效率[D];中国农业大学;2015年

5 白海栋;SMYD3在牛着床前胚胎发育及胎儿成纤维细胞生长中作用的研究[D];内蒙古大学;2015年

6 赵二虎;去甲基化酶KDM4C影响肿瘤细胞增殖与代谢重编程的分子机制研究[D];西南大学;2015年

7 魏兴林;基于piggyBac基因抓捕体系的重编程相关基因的高通量筛选[D];中国农业大学;2014年

8 陈曦;丙戊酸对人骨髓来源的细胞重编程作用的研究[D];吉林大学;2016年

9 翟英颖;丙戊酸促进小鼠成纤维细胞重编程机制的研究[D];吉林大学;2016年

10 王术勇;小分子化合物介导谱系重编程获取内胚层祖细胞及其相关机制研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2016年

相关硕士学位论文 前10条

1 武丽琼;重编程中间态细胞（KMEG-prCs）的鉴定及二次重编程研究[D];内蒙古大学;2015年

2 白权子;OsBBM1重新沉默的表观机制探究和OsPIE1基因的功能探究[D];华中农业大学;2015年

3 李梦娟;体细胞及肿瘤细胞重编程的研究和CRISPR-Cas9技术在急性早幼粒性白血病中应用研究[D];复旦大学;2014年

4 刘红;无线传感器网络重编程协议Rateless Deluge安全性研究与改进[D];南京航空航天大学;2014年

5 汪治理;基于代码差异的无线传感器网络重编程方法研究[D];南京航空航天大学;2014年

6 贾文超;重编程因子与TAT融合蛋白的原核、真核表达研究[D];西北农林科技大学;2015年

7 陶佳;DOT1L抑制剂对猪着床前克隆胚体外发育及H3K79二甲基化重编程的影响[D];安徽农业大学;2014年

8 魏超;猪不完全重编程诱导多能干细胞的获取及生物学特性[D];安徽农业大学;2014年

9 秦胜堂;体细胞重编程过程中Pkm2表达特征和功能研究[D];大连医科大学;2015年

10 王燕;基于纳米基因传递系统的直接重编程：诱导分化成肝脏样细胞的研究[D];江苏大学;2016年

，

本文编号：1652344