猪流行性腹泻病毒S1基因在昆虫细胞中的表达与鉴定

发布时间：2018-03-26 03:37

  本文选题：猪流行性腹泻病毒　切入点：S蛋白　出处：《中国动物传染病学报》2017年03期

【摘要】：本文以猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)流行毒株FJzz1/2011株的S1蛋白的切割位点设计合成特异性引物,通过RT-PCR扩增获得S1基因,将其克隆至转移载体p Fast Bac HTA中,获得了重组质粒p Fast Bac HTA-S1,将该重组质粒转化E.coli DH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒r Bacmid-S1,再将重组穿梭质粒r Bacmid-S1转染Sf9细胞,48 h后即可观察到明显的细胞病变。将收获的r Bac-S1-P1代病毒在Sf9细胞上连续传3代后,收获细胞培养物,分别用间接免疫荧光鉴定(indirect immunofluorescence assay,IFA)、SDS-PAGE电泳和Western blot分析。结果显示,P3代重组病毒r Bac-S1感染的细胞均呈现亮绿色荧光,证实表达产物可以被PEDV阳性血清和抗S1蛋白的单抗特异性识别;SDS-PAGE电泳结果显示在大约120 k Da左右可观察到特异性条带;Western blot结果证实该蛋白可以被抗S1蛋白的特异性单抗识别。综上研究结果,证明利用杆状病毒表达系统在Sf9细胞中成功表达了PEDV的S1蛋白,为进一步研究PEDV S蛋白的抗原性奠定了基础。
[Abstract]:In this paper, porcine epidemic diarrhea virus (Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV) FJzz1/2011 strains strain S1 protein cleavage site of primers were designed by RT-PCR, S1 gene was amplified, cloned into transfer vector p Fast Bac HTA, P Fast Bac to get the recombinant plasmid HTA-S1, the recombinant plasmid was transformed into E.coli DH10Bac competent cells to obtain the recombinant shuttle plasmid R Bacmid-S1, then the recombinant plasmid R Bacmid-S1 was transfected into Sf9 cells after 48 h can be observed after r cell lesions. Bac-S1-P1 virus in Sf9 cells for 3 generations after the cell cultures were harvested respectively, using indirect immunofluorescence assay (indirect immunofluorescence assay, IFA), SDS-PAGE electrophoresis and Western blot analysis. The results showed that P3 generation of recombinant virus R Bac-S1 infected cells showed bright green fluorescence, confirmed the expression products Identify specific PEDV positive serum and the monoclonal antibody against S1 protein; SDS-PAGE electrophoresis results showed that about 120 K Da can be observed in specific bands; Western blot confirmed the specificity of monoclonal antibodies against the protein can be anti S1 protein. The results prove that, using baculovirus expression system in Sf9 cells the successful expression of PEDV S1 protein, which laid the foundation for the further study of PEDV antigenicity of S protein.

【作者单位】： 中国农业科学院上海兽医研究所;江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心;
【基金】：国家自然科学基金项目(31472207) 国家重点研发计划项目(2016YFD0500100) 国家生猪现代产业技术体系建设项目(CARS-36)
【分类号】：S852.651

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本文编号：1666167