TCDCA对免疫细胞中TGR5介导的凋亡相关信号转导通路的影响

发布时间：2018-03-26 14:44

  本文选题：牛磺鹅去氧胆酸　切入点：NR8383细胞　出处：《内蒙古农业大学》2017年博士论文

【摘要】：牛磺鹅去氧胆酸(Taurochenodeoxycholic Acid,TCDCA)作为胆汁酸(Bile Acid,BA)的主要活性成分之一,能够通过多种信号转导通路诱导细胞凋亡而发挥抗炎及免疫调节作用。本研究以NR8383大鼠肺泡巨噬细胞为研究对象,分别开展了TCDCA对NR8383细胞凋亡、NR8383细胞中PKC—JNK/P38—5 信号转导通路以及NR8383细胞分泌IL-1 β和TNF-α的影响,旨在分析TCDCA对免疫细胞凋亡的调节作用及其调控机制,探讨TCDCA调控免疫细胞凋亡对免疫细胞凋亡分泌细胞因子的影响,进而深入揭示TCDCA的抗炎免疫调节作用与其调控免疫细胞凋亡之间的关系。具体研究内容如下:(1)TCDCA对NR8383细胞凋亡的影响采用脂质体转染法将PCMV-TGR5真核表达载体转染至低表达TGR5受体的NR8383细胞中;采用qPCR法检测NR8383细胞中TGR5受体及相关凋亡蛋白caspase-3和caspase-8的基因表达量;采用Western Blot法检测NR8383细胞中TGR5受体蛋白表达量;采用流式细胞术检测TCDCA作用后NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞凋亡率;采用ELISA法检测TCDCA对NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞中caspase-3和caspase-8活性的影响。结果显示,TGR5受体能够在NR8383细胞中高效表达,成功构建了高表达TGR5受体的NR8383细胞(NR8383-TGR5细胞)。NR8383-TGR5细胞中TGR5的mRNA及蛋白表达量均极显著性高于NR8383细胞(P0.01)。TCDCA作用后对NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞凋亡率影响的研究结果显示,与NR8383组相比,TCDCA(10 μM)可显著性提高NR8383细胞的凋亡率(P0.05),TCDCA(100 μM)可极显著性提高NR8383细胞的凋亡率(P0.01)。与 NR8383-TGR5 组相比,TCDCA(10 uM,100 μM)可极显著性提高 NR8383-TGR5细胞的凋亡率(P0.01)。TCDCA(10 μM,100 μM)作用后,NR8383-TGR5 细胞的凋亡率极显著性高于NR8383细胞(P0.01)。TCDCA对NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞中相关凋亡蛋白caspase-3和caspase-8表达量的影响研究结果显示,与NR8383组及NR8383-TGR5组相比,TCDCA(1 μM,10 uM,100 μM)均可极显著性提高 NR8383 细胞和 NR8383-TGR5细胞的 caspase-3 基因表达量(P0.01)。且 TCDCA(10 μM)和 TCDCA(100 μM)作用后,NR8383-TGR5组的caspase-3 mRNA表达量分别极显著性(P0.01)和显著性(P0.05)高于NR8383组。与NR8383组相比,TCDCA(100μM)可极显著提高 caspase-3 活性(P0.01),与 NR8383-TGR5 组相比,TCDCA(10 μM,100 μM)可极显著性提高 caspase-3 活性(P0.01),且 TCDCA(1 μM,10 μM,100μ M)作用后,NR8383-TGR5组的caspase-3活性极显著性高于NR8383组(P0.01)。与NR8383组相比,TCDCA(100 μM)可极显著性提高caspase-8的基因表达量(P0.01),与 NR8383-TGR5 组相比,TCDCA(10 μM,100 μM)可极显著性提高caspase-8基因表达量(P0.01),且TCDCA(100 μM)作用后,NR8383-TGR5组的caspase-8基因表达量显著性高于NR8383组(P0.05)。与NR8383组相比,TCDCA(100 μM)可极显著性提高caspase-8活性(P0.01),与NR8383-TGR5 组相比,TCDCA(1 μM)可显著性(P0.05)而 TCDCA(100 μM)可极显著性提高 caspase-8 活性(P0.01),且 TCDCA(1 μM)和 TCDCA(100 μM)作用后,NR8383-TGR5组的caspase-8活性分别显著性(P0.05)和极显著性(P0.01)高于 NR8383 组。(2)TCDCA对NR8383细胞中PKC—JNK/P38—p53信号转导通路的影响利用磷脂酶 C-β(Phospholipase C-β,PLC-β)特异性阻断剂 U73122 研究了 TCDCA 对其下游因子蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)表达及活性的影响。采用qPCR法检测TCDCA对NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞中PKC基因表达量的影响;采用Western Blot 法检测 TCDCA 对 NR8383 细胞及 NR8383-TGR5 细胞中 PKC 和 pPKC 蛋白表达量的影响。结果显示,与NR8383组及NR8383-TGR5组相比,TCDCA(100μM)能极显著性提高NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的PKC mRNA表达量(P0.01),且TCDCA作用后NR8383-TGR5组的PKC基因表达量极显著性高于NR8383组(P0.01),而U73122能极显著性降低NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的PKC基因表达量(P0.01)。与 NR8383 组及 NR8383-TGR5 组相比,TCDCA(100 μM)能极显著性提高NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的PKC和pPKC蛋白表达量(P0.01),而U73122能极显著性降低NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的PKC和pPKC蛋白表达量(P0.01)。利用PKC特异性阻断剂G6 6983研究了 TCDCA对其下游因子c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal Kinase,JNK)和P38表达及活性的影响。采用qPCR法检测TCDCA对NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞中JNK和P38基因表达量的影响;采用Western Blot 法检测 TCDCA 对 NR8383 细胞及 NR8383-TGR5 细胞中 JNK、pJNK、P38、pP38蛋白表达量的影响。结果显示,与NR8383组及NR8383-TGR5组相比,TCDCA(100 μ M)能极显著性提高NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的JNK mRNA表达量(P0.01),而Go 6983能极显著性降低NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的JNK 基因表达量(P0.01)。与 NR8383 组及 NR8383-TGR5 组相比,TCDCA(100 μM)能极显著性提高NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的JNK和pJNK蛋白表达量(P0.01),且NR8383-TCR5组的JNK和pJNK蛋白表达量极显著性低于NR8383组(P0.01)。Go 6983能极显著性降低NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的JNK和PJNK蛋白表达量(P0.01)。TCDCA(100μM)能极显著性提高NR8383细胞及NR8383-TGR5 细胞的 P38 mRNA 表达量(P0.01),且 NR8383-TGR5 组的 P38 mRNA表达量极显著性高于NR8383组(P0.01),而Go 6983能极显著性降低NR8383细胞及 NR8383-TGR5 细胞的 P38 基因表达量(P0.01)。与 NR8383 组及 NR8383-TGR5组相比,TCDCA(100μM)能极显著性提高NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的P38和pP38蛋白表达量(P0.01),且NR8383-TGR5组的P38蛋白表达量极显著性低于NR8383组(P0.01),而Go 6983能极显著性降低NR8383细胞的P38蛋白表达量(P0.01)。分别利用JNK特异性阻断剂SP600125和P38特异性阻断剂SB203580,研究了TCDCA对其下游因子p53表达及活性的影响。采用qPCR法检测TCDCA对NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞中p53基因表达量的影响;采用Western Blot法检测TCDCA对NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞中p53和pp53蛋白表达量的影响。结果显示,与NR8383组及NR8383-TGR5组相比,TCDCA(100 μ M)能极显著性提高NR8383细胞及 NR8383-TGR5 细胞的p53 mRNA 表达量(P0.01),而 SP600125 和 SB203580 均能极显著性抑制NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的p53 mRNA表达量(P0.01),且SP600125作用后NR8383-TGR5组的p53 mRNA表达量极显著性低于NR8383组(P0.01)。与 NR8383 组及 NR8383-TGR5 组相比,TCDCA(100 μM)能极显著性提高NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的p53和pp53蛋白表达量(P0.01),而SP600125能极显著性降低NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的p53和pp53蛋白表达量(P0.01),且 TCDCA(100 μM)或 SP600125 作用后 NR8383-TGR5 组的 pp53 蛋白表达量均极显著性高于NR8383组(P0.01)。SB203580能极显著性降低NR8383细胞的P53和pp53蛋白表达量(P0.01),并极显著性降低NR8383-TGR5细胞的p53蛋白表达量(P0.01),且SB203580作用后NR8383-TGR5组的p53和pp53蛋白表达量分别显著性(P0.05)和极显著性(P0.01)高于NR8383组。(3)TCDCA对NR8383细胞分泌IL-1β和TNF-α的影响采用qPCR法检测TCDCA对NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞中白介素-1 β(Interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)基因表达量的影响;采用ELISA法检测TCDCA对NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞中IL-1β和TNF-α蛋白表达量的影响。结果显示,与NR8383组及NR8383-TGR5 组相比,脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)能极显著性提高 NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的IL-1β基因和蛋白表达量(P0.01)。与LPS对照组相比,100 μ M TCDCA能极显著性降低LPS诱导的IL-1 β的基因和蛋白表达量(P0.01)。另外,SP600125 和 SB203580 作用后,与 NR8383 组和 NR8383-TGR5 组相比,IL-1β的基因及蛋白表达量极显著性降低(P0.01)。与NR8383组及NR8383-TGR5组相比,LPS能极显著性提高NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的TNF-α的基因和蛋白表达量(P0.01)。与LPS对照组相比,100 μM TCDCA能极显著性降低LPS诱导的TNF-a的基因和蛋白表达量(P＜0.01)。另外,SP600125和SB203580作用后,与NR8383组和NR8383-TGR5组相比,TNF-α的基因及蛋白表达量极显著性降低(P0.01)。通过本研究可主要得出以下结论:(1)TCDCA能显著性提高NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的凋亡率,且10μM和100 μ M浓度的TCDCA作用后,NR8383-TGR5细胞的凋亡率显著性高于NR8383细胞的凋亡率;TCDCA能显著性增加NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞中caspase-3和caspase-8的表达及活性,且NR8383-TGR5细胞中caspase-3和caspase-8的表达及活性均显著性高于NR8383细胞。因而提示,TCDCA提高NR8383细胞的凋亡率与其激活TGR5受体有关;(2)TCDCA能通过TGR5受体介导JNK、pJNK、P38、pP38、p53、pp53的表达量显著性升高,且在U73122、Go 6983、SP600125、SB203580作用后均能显著性降低其相应下游产物的表达量。由此表明,TCDCA诱导NR8383细胞凋亡与其激活TGR5受体介导的PKC—JNK/P38—p53信号转导通路有关;(3)TCDCA能显著性降低LPS诱导的NR8383细胞和NR8383-TGR5细胞中IL-1β和TNF-α的mRNA及蛋白表达量。此外,与NR8383组和NR8383-TGR5组相比,SP600125和SB203580作用后,IL-1β和TNF-α的基因及蛋白表达量极显著性降低。这一结果提示,TCDCA能够通过PKC—JNK/P38信号转导通路抑制NR8383细胞对IL-1β和TNF-α的分泌。综上所述,TCDCA提高NR8383细胞凋亡率,并抑制其分泌炎性细胞因子TNF-α和IL-1 β,与其激活TGR5受体介导的PKC—JNK/P38—p53细胞凋亡信号转导通路有关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.4

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本文编号：1668294