绵羊肺炎霉形体的培养纯化研究与间接ELISA检测抗体方法的初步建立

发布时间：2016-11-07 17:30

本文关键词：绵羊肺炎霉形体的培养与保存，由笔耕文化传播整理发布。

《四川农业大学》 2007年

易佳

【摘要】： 绵羊肺炎霉形体(MO)所致绵羊肺炎霉形体病是目前羊场中发病率和致死率最高的疾病之一。本研究通过对绵羊肺炎霉形体进行菌株纯化，对比不同培养基，含不同血清的对比培养基和含不同抗生素浓度的对比培养基对绵羊肺炎霉形体生长的影响，从而纯化了绵羊肺炎霉形体菌株Y；优化筛选出以加入10％的猪血清和正常抗生素浓度FM-4培养基培养绵羊肺炎霉形体效果最好，为进一步研究其病原学和致病机理打下基础。在改良FM-4液体培养基中接种绵羊肺炎霉形体，48h后收集菌体，经蛋白酶抑制剂处理；通过抗原提取方法的筛选，采用低渗-冻融-超声裂解法获得MO菌体蛋白作为包被抗原，，初步建立了检测该病抗体的间接ELISA方法。通过试验比较，确定了ELISA的最佳反应条件为：抗原包被浓度为17.5μg/ml；以含1％BSA的PBST为最佳封闭液，37℃反应2h；血清最佳工作浓度为1:320，37℃反应1h；酶标羊抗兔IgG的最佳工作浓度为1:5000，37℃反应1h；阴阳性临界值为0.084。菌体蛋白能阻断阳性血清与相应包被抗原的反应；与丝状支原体山羊亚种阳性血清、布氏杆菌阳性血清、链球菌C群阳性血清均无交叉反应；表明特异性好。包被好的反应板4℃保存3个月，其灵敏度不变。间接ELISA能够检测出的血清最高效价为1:2560，而间接血凝试验能检测的最高效价仅为1:64。建立的间接ELISA检测绵羊肺炎霉形体抗体方法，具有操作简单、灵敏度高、特异性好、稳定可靠等优点，适用于该病的诊断与疫病普查。

【关键词】：
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：S852.62
【目录】：

中文摘要7-8

Abstract8-9

文献综述9-16

1 历史与分布9-10

2 病原学10

2.1 分类及形态特性10

2.2 培养特性10

3 抗原结构10-11

4 流行病学11

5 临床症状及病理变化11-12

5.1 临床症状11-12

5.2 病理变化12

6 诊断方法12-14

6.1 病原学培养诊断12-13

6.2 血清学检测13-14

6.3 分子生物学诊断14

7 防治14-16

7.1 药物治疗14-15

7.2 防制措施15-16

研究目的意义16-17

材料与方法17-23

1 材料17

1.1 菌株17

1.2 血清17

1.3 试剂17

1.4 仪器17

2 方法17-23

2.1 绵羊肺炎霉形体菌株纯化17

2.2 绵羊肺炎霉形体培养条件优化17-18

2.3 绵羊肺炎霉形体菌体的收集18-19

2.4 绵羊肺炎霉形体菌体全蛋白的制备19-20

2.5 兔抗绵羊肺炎霉形体阴性和阳性血清的制备20

2.6 间接ELISA的操作方法20-21

2.7 间接ELISA最佳反应条件的选择21

2.8 间接ELISA方法阴阳性临界值的确定21-22

2.9 特异性试验22

2.10 重复性试验22

2.11 保存期试验22

2.12 敏感试验22-23

结果23-32

1 绵羊肺炎霉形体的培养纯化23-25

1.1 绵羊肺炎霉形体的菌株纯化23-24

1.2 绵羊肺炎霉形体培养条件优化24-25

2 菌体全蛋白的制备方法25-26

3 兔抗绵羊肺炎霉形体阴性和阳性血清的制备26-27

4 间接ELISA最佳反应条件的选择27-29

4.1 最佳抗原和血清工作浓度的选择27

4.2 酶标羊抗兔IgG最佳工作浓度的选择27-28

4.3 酶标羊抗兔IgG最佳工作时间的选择28

4.4 不同封闭液及封闭时间的选择28

4.5 阴性、阳性血清最适反应时间的选择28-29

5 间接ELISA方法阴阳性临界值的确定29

6 特异性试验29-31

6.1 阻断试验29-30

6.2 交叉反应试验30-31

8 保存期试验31

9 敏感试验31-32

讨论32-35

结论35-36

参考文献36-42

致谢42-43

攻读硕士学位期间发表文章目录43

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【引证文献】

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