副猪嗜血杆菌环介导等温扩增快速检测方法的建立

发布时间：2018-03-29 20:30

  本文选题：副猪嗜血杆菌　切入点：OMP　出处：《河北农业大学》2013年硕士论文

【摘要】：副猪嗜血杆菌病（Haemophilus parasuis，Hps）又称多发性纤维素性浆膜炎和关节炎，也称革拉瑟氏病（Glasser’s disease），由副猪嗜血杆菌引起。副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道的常在菌，，在正常条件下不表现任何临床症状，但在特定条件下可引起严重的全身性疾病。该菌在环境中普遍存在，世界各地都有。近些年来随着世界养猪业的发展，该病已成为全球范围内影响养猪业发展的新发细菌性传染病，它常作为继发的病原菌和其它主要病原混合感染，给全球的养猪业带来了巨大的经济损失，严重阻碍了养猪业的健康发展，故建立快速、准确的检测方法是成功防治该病的关键。 目前针对副猪嗜血杆菌的检测方法主要有细菌分离培养、免疫学（抗体监测）方法及PCR法。但副猪嗜血杆菌的分离培养操作极其繁琐，检测所需时间长且灵敏度低；免疫学方法的灵敏度也不理想，PCR法虽敏感、快速但其需要昂贵的仪器设备和繁琐的过程，使其很难在基层推广应用。 环介导等温扩增法（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是由日本科学家Notomi研发的新型核酸扩增技术，它能够在恒温条件下特异性地扩增靶序列，该法以高效、快速且成本低廉、操作简便等优点迅速在诸多领域广泛应用。 本试验是采用环介导等温扩增技术检测副猪嗜血杆菌，以副猪嗜血杆菌的高保守序列OMP P2基因序列（NZ_ABKM01000007.1）为靶基因，根据LAMP引物设计的原则，应用Primer Explorer3.0软件针对6个特定区域，设计出4条特异性引物。在链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下，对模板DNA进行等温扩增，并对LAMP反应体系中内外（F3:FIP和B3:BIP）引物、MgSO4、dNTP及Bst酶的浓度、反应时间和反应温度等扩增条件进行优化，最终确定了25μL的LAMP最佳反应体系：内引物（FIP和BIP）各1.6mmol/L，外引物（F3和B3）各0.2mmol/L；镁离子的浓度为3.0mmol/L；dNTP浓度为3.0mmol/L；8U的BstDNA聚合酶的添加量为0.8μL，2.5μL10×BstDNA聚合酶反应缓冲液，2μLDNA模板，并用无菌双蒸水补足体系。LAMP的基本反应过程为：先将反应混合物置于62℃水浴锅中反应40min，然后在80℃水浴锅中水浴10min终止反应，反应结束后肉眼观察有无白色焦磷酸镁沉淀来判断LAMP反应是否发生，亦可加入荧光染料或用1%琼脂糖凝胶电泳检测。 以PCR方法作为对照，测定LAMP法的灵敏度。结果表明， PCR最低检测DNA量为20pg/μL；而LAMP最低检测DNA量为0.2pg/μL，LAMP比PCR方法敏感100倍；同时利用LAMP方法对猪胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪肺炎支原体9种常见病原进行特异性试验，结果表明，9种病原体LAMP反应均为阴性，说明LAMP方法具有良好的特异性。 综上，本试验建立的LAMP体系为检测副猪嗜血杆菌提供了快速、灵敏、特异高效的检测方法。该法操简便易行，对操作人员技术水平要求并不高且不需要昂贵的仪器设备，对于基层和实验室应用均具有良好前景。
[Abstract]:In recent years , with the development of the world ' s pig industry , the disease has become a new bacterial infectious disease affecting the development of pig industry worldwide .

At present , the detection method for the parasporis mainly includes the bacteria separation culture , the immunology ( antibody monitoring ) method and the PCR method , but the separation and culture operation of the parasporcini is extremely complicated , the required time is long and the sensitivity is low ;
The sensitivity of immunological method is not ideal , PCR method is sensitive , rapid , but it needs expensive instruments and equipment and complicated process , which makes it difficult to popularize and apply in the base course .

Loop - mediated isothermal amplification ( LAMP ) is a new nucleic acid amplification technology developed by Notomi , a Japanese scientist , which can amplify the target sequence at constant temperature . The method is widely used in many fields with the advantages of high efficiency , fast and low cost , simple operation and the like .

According to the principle of LAMP primer design , four specific primers were designed according to the principle of LAMP primer design .
the concentration of magnesium ions is 3.0 mmol / L ;
the concentration of dps is 3.0 mmol / L ;
8U BstDNA polymerase was added in 0.8 渭L , 2.5 渭L 脳 BstDNA polymerase reaction buffer and 2 渭L DNA template . The basic reaction procedure of LAMP was to put the reaction mixture in a water bath at 62 鈩

本文编号：1682724