亮氨酸对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白合成影响和机理研究

发布时间：2018-03-30 09:41

本文选题：奶牛乳腺上皮细胞　切入点：亮氨酸　出处：《吉林大学》2015年硕士论文

【摘要】：本试验主要以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型，研究亮氨酸浓度对乳腺上皮细胞中酪蛋白合成的影响和机理研究，旨在揭示不同浓度的亮氨酸在转录和翻译水平上调控酪蛋白合成的分子机理，以提高乳蛋白的含量，从而为改善乳品质提供一定的理论依据；此外该研究还以永生化的奶牛乳腺上皮细胞为模型，建立了酪蛋白合成的非细胞体系（cell-free model），以模拟亮氨酸调控乳蛋白合成的信号通路，从而为体外氨基酸对乳蛋白合成的研究提供一种新的研究方法。本试验包括以下三部分： 1.以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型，采用噻唑蓝（MTT）法研究不同浓度的亮氨酸添加水平和培养时间对乳腺上皮细胞增殖的影响，得出亮氨酸作用的最佳条件（包括作用浓度和作用时间），为后续试验提供参考，同时也为阐明亮氨酸能促进乳腺上皮细胞增殖的机制提供一些依据。试验采用完全随机设计，以0.00mM/L亮氨酸处理为对照组（0组），试验组培养基分别添加0.1125mM/L（0.25组），，0.225mM/L（0.5组），0.45mM/L（1组），0.9mM/L（2组），1.8mM/L（4组），3.6mM/L（8组），7.2mM/L（16组），14.4mM/L（32组）的亮氨酸；培养时间分别为24h、48h和72h。试验重复3次。结果表明：亮氨酸在0.45~3.6mM/L（1组~8组）时对奶牛乳腺上皮细胞的增殖作用明显，且在48h培养时间时其促增殖作用最强（P0.01）。 2.以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型，研究不同浓度的亮氨酸对乳腺上皮细胞中酪蛋白合成相关基因的影响。试验以0.00mM/L亮氨酸处理为对照组（0组），试验组培养基分别添加0.1125mM/L（0.25组），0.225mM/L（0.5组），0.45mM/L（1组），0.9mM/L（2组），1.8mM/L（4组），3.6mM/L（8组），7.2mM/L（16组），14.4mM/L（32组）的亮氨酸。先对细胞进行4h的饥饿处理，然后添加不同水平的亮氨酸处理48h，每个处理3个重复，试验也重复3次。采用荧光定量反转录PCR（RT-PCR）技术检测不同浓度亮氨酸处理条件下酪蛋白及其合成相关基因的表达量，找出最佳的亮氨酸作用浓度。结果表明：1）亮氨酸促进酪蛋白基因表达的最佳浓度为0.9mM/L。此水平下，αs1-酪蛋白(αs1-casein，CSN1S1)、αs2-酪蛋白(αs2-casein，CSN1S2)、β-酪蛋白（β-casein，CSN2）和κ-酪蛋白（κ-casein, CSN3）的基因表达量均显著上调，且与对照组相比差异显著（P0.05）。2）亮氨酸促进酪蛋白合成转录和翻译基因表达的最佳浓度也为0.9mM/L。此水平下，与酪蛋白转录相关JAK2-STAT5信号通路的基因，信号转换和转录激活因子5（Signal transducers and activators of transcription5，STAT5）和酪氨酸激酶2（Janus Kinases2，JAK2）的表达均上调，与对照组相比差异均显著（P0.05）。与酪蛋白翻译相关的mTOR信号通路中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白基因（mammalian target of rapamycin， mTOR）和p70核糖体蛋白S6激酶1（ribosomal protein S6kinase-1，S6K1）基因的表达均上调，而且与对照组相比，二者的基因表达量差异均显著（P0.05），但真核翻译起始因子4E结合蛋白1（Eukaryotic translation initiation factor4E binding protein1，4E-BP1）表达下调，与对照组相比差异也显著（P0.05）。 3.以永生化的奶牛乳腺上皮细胞（CMEC-H）为基础，构建了体外模拟氨基酸调控乳蛋白合成的非细胞体系（cell-free model）。此非细胞体系构建之前，探究了穿针法（Gauge26，G26）温和裂解CMEC-H的方法。该非细胞体系主要由粗提溶酶体组分（Crude lysosomes，CLF）和胞浆蛋白（Supernant-100，S100）组成。结果表明：所构建的非细胞体系能有效模拟氨基酸感应哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路中的两项典型特征：必需氨基酸和亮氨酸都能够激活蛋白mTOR，使mTOR在Ser2448位点发生磷酸化；激活之后的mTOR能从胞浆蛋白组分中移至粗提溶酶体组分。另外研究还发现了一种较好地温和裂解CMEC-H的方法，即穿G26针孔25次。结论：综合本研究结果，当亮氨酸浓度为0.9mM/L时，奶牛乳腺上皮细胞的促增殖作用最大，并显著促进了4种酪蛋白编码基因的表达量和酪蛋白合成相关转录和翻译基因的表达。而且以永生化的奶牛乳腺上皮细胞为基础，所构建的非细胞体系能有效模拟氨基酸感应乳蛋白合成信号通路的主要特征。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S823

【参考文献】