旋毛虫微卫星标记及其在虫种鉴定中的应用

发布时间：2018-04-02 14:34

本文选题：旋毛虫　切入点：微卫星标记　出处：《吉林大学》2017年硕士论文

【摘要】：旋毛虫病是由旋毛虫引起的一种严重的人兽共患病。目前国际公认的旋毛线虫属分为9个种及3个未命名的基因型,他们分别是T.spiralis,T1;T.nativa,T2;T.britovi,T3;T.pseudospiralis,T4;T.murrelli,T5;T6;T.nelsoni,T7;T8;T9;T.papuae,T10;T.zimbabwensis,T11;T.patagoniensis,T12。旋毛虫宿主分布范围广泛,可感染人及百余种哺乳动物、爬行动物和鸟类,呈全球性分布。人类主要是通过生食或半生食感染旋毛虫肌幼虫的猪肉而引发感染。旋毛虫感染在中国每年造成约18亿人民币的经济损失,而美国及欧盟更是每年高达10亿美元和5.7亿美元。同时,该病的人畜共患性也给疫区人民的身体健康带来严重危害。准确鉴别旋毛虫种类,不仅是研究旋毛虫的基础及前提,也对防治旋毛虫病具有重要意义。长期以来,旋毛虫虫种是依据成虫的形态、流行病学特点等进行分类鉴定。然而,不同旋毛虫种间个体差异并不明显,传统的分类方法的局限性越来越突出,迫切需要研发新的分类方法。分子生物学的发展、测序技术的进步等给旋毛虫分类技术带来了新思路,近年来科学家们不断尝试从分子水平探讨旋毛虫的遗传关系分析及分类鉴定方法。SSR是众多分类鉴定方法中颇具优点的一种。这主要是因为SSR本身具有分布广泛、多态性高、种类多、孟德尔共显性遗传等优点。SSR标记法十分适合用于寄生虫分类鉴定方法的研究。本研究根据Genebank上已公布的旋毛虫T1全基因组序列,利用程序MISA对基因组中的SSR进行查找,之后利用primer3-1.1.4-WINXP程序对SSR引物进行设计并送公司合成了50对引物。利用3%琼脂糖电泳技术分离SSR-PCR产物,初筛选出能够用于区分旋毛虫遗传差异较大的四个虫种(T.spiralis(T1),T.native(T2),T.britovi(T3),T.pseudospiralis(T4))的10对引物,这10对引物兼具扩增条带清晰、多态性高、重复性好等优点。进而优化了每对引物的退化温度、SSR-PCR反应体系及程序,最终确定的SSR-PCR反应体系为:20μL反应体系中Ex-Taq酶0.5 U,上下游引物的终浓度各为0.1 pmol/μL,DNA模板终浓度为7.5 ng/μL;确定的SSR-PCR反应程序为:98℃预变性5 min;98℃10 s,56℃(或54℃或58℃,不同引物退火温度不同)30 s,72℃30 s,35个循环;72℃延伸7 min。之后,使用8%聚丙烯酰胺变性PAGE电泳技术分离SSR-PCR产物,最终筛选出了可用于12个旋毛虫虫种及基因型鉴定的两对SSR核心引物(8号、10号引物),每对核心引物都能够完全区分12个旋毛虫虫种及基因型。为了进一步验证本研究建立的旋毛虫虫种分类鉴定的SSR-PCR技术体系,分别使用本实验建立的SSR-PCR法(利用筛选到的10号引物)和多重PCR法同时对猪和犬体内分离的未知旋毛虫虫种进行虫种鉴定,两种方法鉴定的结果一致。实践证明本研究建立的用于旋毛虫虫种分类鉴定的SSR-PCR技术体系方法可行、结果可靠。本文建立了适用于旋毛虫虫种分类鉴定的SSR-PCR技术体系,实现了利用SSR标记技术通过单对引物对旋毛虫的12个虫种及基因型进行分类鉴定,为旋毛虫病的病原学、流行病学的研究以及旋毛虫病的防治等方面奠定了坚实的基础。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.7

【参考文献】