泌乳奶牛乳腺中小肽转运载体的鉴定及其生理特性的研究

发布时间：2018-04-04 00:54

本文选题：奶牛　切入点：乳腺　出处：《内蒙古农业大学》2015年博士论文

【摘要】：本论文主要研究泌乳中期奶牛乳腺组织及乳腺上皮细胞中小肽转运载体(Pep Ts)的表达定位及其潜在功能的调控,目的是确定泌乳奶牛乳腺中存在哪些小肽转运载体,在乳腺上皮细胞摄取小肽时所起的作用、发生的变化及其机理的初步探讨。从而为后期进一步深入研究小肽转运载体的分子功能及转运性能提供理论依据,也为完善小肽的摄取代谢模型及乳蛋白前体物的合理配比模块提供依据与积累资料。本论文主要包括四个试验,其结果如下:1.泌乳奶牛乳腺中小肽转运载体m RNA水平的鉴定随机采集三头泌乳中期荷斯坦奶牛的乳腺组织,部分样品进行提取组织总RNA,其余用于乳腺上皮细胞的培养,分别运用实时荧光定量PCR的方法和琼脂糖凝胶技术,通过基因转录水平检测泌乳动物乳腺中重要的小肽转运载体Pep T1、PepT2的表达。试验结果显示:无论是在泌乳奶牛乳腺组织中还是乳腺上皮细胞中,两种小肽转运载体的引物都存在特异性的扩增,并有着高度明显的表达;测序技术也证实了结果的可靠性,经分析比对后发现与目标序列同源性达到了100%,这说明泌乳奶牛乳腺中存在PepTs基因的表达。2.泌乳奶牛乳腺中Pep Ts的免疫学检测与定位首先从奶牛乳腺组织和体外培养的奶牛乳腺上皮细胞中分别提取总蛋白,用Western Blot的方法检测了小肽转运载体Pep T1、PepT2两种蛋白的表达,随后制作切片采用IHC(免疫组织化学)与ICC(免疫细胞化学)试验技术分别在奶牛乳腺组织及乳腺上皮细胞中对PepTs的分布进行了定位,最后用免疫荧光对结果进行了进一步证实。试验结果显示:两种小肽转运载体蛋白在泌乳奶牛乳腺中均有高强度的表达,PepT1主要存在于奶牛乳腺的细胞膜上,PepT2则主要存在于奶牛乳腺的细胞质中。3.奶牛乳腺中小肽转运载体的理化特性规律及功能调控试验从奶牛乳腺组织中提取上皮细胞进行纯化培养,命名为原代,待其生长到总细胞数的80%~90%时,以1×105个/孔的密度接种并进行细胞传代处理,一直传到第五代,分别提取其总RNA进行RT-PCR试验,每个试验重复6次。结果发现:细胞培养代数对Pep Ts基因的表达影响显著,其中第二代细胞相对于其它几代,无论对PepT1,还是Pep T2的影响差异均显著(P㩳0.05),所以后续试验均选用第二代乳腺上皮细胞。随后设定不同的培养天数(第1 d~6 d)六个同一时间点,以每组试验6个重复,考察细胞分化过程中对PepTs基因表达的影响规律。结果发现:PepTs mRNA在奶牛乳腺上皮细胞上的表达是依赖时间进程而变化的,呈现先升高后下降的趋势,并在第5天高度表达(P㩳0.05)。为了进一步系统的研究泌乳奶牛乳腺中Pep Ts的调控规律,试验设计在培养基中添加不同浓度的泌乳相关激素(培养24 h)及不同的肽底物(48 h)进行培养乳腺上皮细胞。试验结果显示:与不添加小肽、只添加游离氨基酸组相比,添加0.0002、0.002、0.02、0.2 IU/m L的Prolactin,50、500、5000 ng/m L的Insulin,100、1000 ng/m L的Hydrocortisone均可显著的增加Pep Ts mRNA基因的表达(P㩳0.05);添加10%Thr-Phe-Phe,5%Phe-Phe,10%Leu-Leu和6μg/m L Leu-Leu时,PepT1、PepT2及αs1 casion基因mRNA的丰度均表现最高(P㩳0.05),且有利于乳蛋白的合成。4.奶牛乳腺小肽转运载体基因真核表达载体的构建及在乳腺上皮细胞中的表达泌乳奶牛小肽转运载体Pep T1基因采用PCR方法,进行扩增克隆,通过限制性内切酶进行酶切反应和T4连接酶连接,重组质粒,构建真核表达载体并命名为p IRES2-EGFP-Pep T1。泌乳奶牛寡肽转运载体PepT2委托上海生工生物技术有限公司合成,命名为pc DNA3.1-Pep T2质粒。经测序验证比对无误后将p IRES2-EGFP-Pep T1与pcDNA3.1-Pep T2转染奶牛乳腺上皮细胞,用RT-PCR方法检测单独转染后对小肽转运载体表达的稳定性及对乳蛋白基因表达量的变化。结果显示:成功构建了奶牛乳腺I型小肽转运载体的真核表达载体p IRES2-EGFP-Pep Ts与Ⅱ型小肽转运载体的真核表达载体pcDNA3.1-Pep T2,完成了p IRES2-EGFP-Pep Ts与pcDNA3.1-PepT2真核表达质粒瞬时转染奶牛乳腺上皮细胞;转染后得出,与对照组相比,转染质粒的乳腺上皮细胞中Pep Ts基因得到了高效的表达,αs1 casein基因呈现不同程度的上调。综合本试验的研究结果可以得出,泌乳奶牛乳腺中不仅存在小肽转运载体Pep T2的表达,也存在小肽转运载体PepT1的表达,在奶牛乳腺组织和乳腺上皮细胞中分别从基因水平和蛋白水平验证了结果的可靠,两种转运蛋白都有高度的表达,然后以奶牛乳腺上皮细胞为平台,系统的证实了细胞分化时期、泌乳相关激素及不同的肽底物均对PepTs的调控有显著的影响,并呈现一定的规律,最后构建了奶牛乳腺中小肽转运载体(p IRES2-EGFP-PepT1和pc DNA3.1-Pep T2),在核酸水平利用RT-PCR方法验证了表达的稳定性,完成了p IRES2-EGFP-PepTs与pcDNA3.1-PepT2真核表达质粒瞬时转染奶牛乳腺上皮细胞,与对照组相比,转染后小肽转运载体和αs1酪蛋白基因均有了显著的表达。
[Abstract]:The expression of Pep T 1 and PepT2 in the mammary gland of lactating dairy cow was studied by means of real - time fluorescence quantitative polymerase chain reaction ( RT - PCR ) and agarose gel technique . In order to study the regulation of Pep Ts in the mammary gland of lactating dairy cows , the expression of Pep Ts mRNA was increased significantly ( P ? 0.05 ) . The expression vector pIRES2 - EGFP - Pep - Ts and pcDNA3.1 - Pep - T2 were added to the mammary epithelial cells . The results showed that the expression vector pIRES2 - EGFP - Pep - Ts and pcDNA3.1 - Pep - T2 were successfully transfected into the mammary epithelial cells . The expression of the small peptide transport vector Pep _ ( 2 ) was observed in the mammary gland of the lactating dairy cow , and the expression of the small peptide transport vector ( PepT1 ) was also observed . At the same time , the expression of the small peptide transport vector ( pIRES2 - EGFP - PepT1 and pcDNA 3.1 - Pep _ 2 ) was verified by RT - PCR .

【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S823

【参考文献】