日本血吸虫Wnt2、Wnt4信号转导蛋白功能的初步研究

发布时间：2018-04-12 13:13

  本文选题：日本血吸虫 + Wnt2　； 参考：《吉林农业大学》2016年硕士论文

【摘要】：日本血吸虫(Schistosoma japonicum Katsurada)是一种分布广泛人畜均可感染的寄生虫,是危害人畜最为严重的寄生虫之一。Wnt信号通路存在于多细胞生物体内,参与调节细胞的分化、胚胎发育、体轴的建立,调节着机体的生长与发育。被分泌到胞外Wnt蛋白与相应跨膜受体Frizzled相结合,激活下游靶基因进而产生相应生物学效应。为了解Wnt家族基因在日本血吸虫发育中的调节,本研究对日本血吸虫不同发育阶段的Wnt家族基因m RNA进行比较分析以及利用体内、体外两种方式对Sj Wnt2、Sj Wnt4靶基因进行抑制,初步探究Wnt家族基因在虫体发育中的作用。同时,通过免疫荧光与Western blot技术对Wnt、Frizzled真核表达载体重组蛋白进行鉴定分析,为下一步确定受配体识别关系建立实验基础。1.Wnt家族基因在不同发育阶段虫体及不同宿主来源的虫体间m RNA水平比较分析通过荧光定量PCR比较了日本血吸虫Wnt1、Wnt2、Wnt4、Wnt5、Wnt11在不同发育阶段及不同性别中相对表达水平,结果显示,在早期发育阶段Sj Wnt1在7d处于最高的表达水平,Sj Wnt2在egg阶段处于一个相对高的的水平,Sj Wnt4、Sj Wnt5在18天表达到达最高,Sj Wnt11在14天与18天这两个阶段中远高于egg阶段,提示Wnt家族基因功能与虫卵发育到性成熟这一重要生理过程密切相关。通过荧光定量PCR分析了单复性感染不同宿主的雌雄血吸虫Wnt家族基因m RNA的表达水平。结果显示:发育不正常的雌雄个体其Wnt基因表达含量高于正常的雌雄个体,推测Wnt信号通路过度表达可能会抑制血吸虫的生长、生殖器官的发育。单性感染的BALB/c小鼠单性雌虫生殖器官处于发育不良的状态,且Wnt家族基因异常高表达,可能会抑制其生殖器官的发育。2.日本血吸虫Wnt2、Wnt4评价实时定量PCR对Sj Wnt2 si RNA小分子进行抑制效果评价,同时对Wnt家族基因及下游部分基因进行体外干扰的评价结果显示:筛选得到最佳抑制效果的si RNA编号为Sj Wnt2-615,对Wnt家族其它基因表达水平进行分析,其靶向性较好。同时对三条信号通路的7个关键分子分析m RNA表达水平,Sj Wnt2基因下调后对Wnt/β-catenin通路、Wnt/Ca2+通路、Wnt/PCP通路有着不同程度的激活。通过体外Sj Wnt4 siRNA干扰,小分子在48h就可以达到很好的抑制效果。体内不同期别干扰效果评价结果显示,14天、42天抑制效果较好且比较稳定,对25天抑制效果有所下降,对雌虫抑制效果略高于雄虫。3.Wnt信号通路受配体的在293T细胞中表达利用荧光显微镜检测脂质体转染的Wnt、Frizzled质粒,结果显示在293T细胞中有表达,在Wnt2、Wnt4与Frizzled5、Frizzled8共转染组,显示共转染质粒可以在同一细胞中共表达。通过Western blot鉴定蛋白分子量与理论分子量大小相一致。本研究运用实时定量方法来评价正常虫体在发育的各阶段中Wnt家族基因的m RNA水平,同时分析了单复性感染25d时其Wnt家族基因m RNA转录水平。筛选出抑制效果最好的Sj Wnt2 si RNA,并确定了最佳的浓度。同时对Wnt家族基因及下游基因干扰效果做出评价。对Sj Wnt4体内外不同时间段的干扰效果进行评价,摸索出最佳的干扰条件。另外,对已构建好的p3x FLAG-Wnts、p RK5-Frizzleds-myc受配体在293T细胞中表达进行鉴定,为下一步对Wnt信号途径在血吸虫生长发育的功能研究奠定实验基础。
[Abstract]:Wnt1 , Wnt2 , Wnt4 , Wnt5 , Wnt11 in different developmental stages of Schistosoma japonicum were analyzed by fluorescence quantitative PCR . Wnt2 , Wnt4 and Frizzled5 , Frizzled8 co - transfected groups were used to evaluate the mRNA levels of Wnt family genes .

【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.7

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