山羊痘病毒Vero细胞适应毒的培育和基于P32蛋白的单克隆抗体制备

发布时间：2018-04-12 16:41

本文选题：GTPV + 实时荧光定量PCR　；参考：《扬州大学》2017年硕士论文

【摘要】：山羊痘病毒(Goatpox virus,GTPV)为急性接触性传染病,可感染各种年龄、性别和品种的山羊,造成山羊发热、皮肤丘疹和黏膜脏器广泛性的痘疹等临床症状,导致生产能力下降,严重威胁国内外养羊业的发展。目前我国防控该病的主要措施是疫苗免疫的方法,但仍时有疫情发生,因此,建立快速诊断该病方法是十分必要的。本研究将在原代胎羊睾丸细胞分离的GTPV-XZ株在Vero细胞进行传代,同时克隆表达GTPVP32蛋白,免疫小鼠制备单抗,为建立快速,操作简便、成本低廉的检测奠定基础。1.GTPV Vero细胞适应毒的培育将分离的山羊痘病毒转接到Vero细胞上进行连续传代,通过20代的传代培养,细胞的CPE趋于稳定,接毒3d后,细胞皱缩拉网,形成许多聚集的细胞团块,5d后细胞开始脱落,在病变达到80%的时候进行收获,继续传代。选取每一代病毒测定TCID50,同时绘制了 GTPVP32基因的标准曲线,使用qRT-PCR对每代病毒进行检测,结果显示前期病毒在Vero细胞上的增殖含量较低,通过连续20代培养之后GTPV的增殖滴度小幅提高并趋于稳定,因此获得了 Vero细胞适应毒。2.GTPV P32基因的原核表达通过克隆P32基因,并将其插入pET-32a表达载体上,转化表达菌株BL21后用IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测结果显示,在37℃、220rpm、1M IPTG条件下,融合蛋白P32-His能以可溶性形式大量表达。经His标签蛋白纯化试剂盒纯化后,获得可溶性的重组蛋白浓度为2.5 mg/mL。使用纯化的P32蛋白免疫BALB/c小鼠制备多抗血清,通过IFA试验结果显示:制备多抗血清能与感染GTPV的Vero细胞产生特异性的荧光,表明重组的P32蛋白有较好的免疫原性,为下一步进行P32蛋白单克隆抗体的制备提供材料。3.抗GTPVP32蛋白单克隆抗体的制备使用纯化的P32-His融合蛋白免疫六周龄BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0进行融合,通过间接ELISA和IFA的方法筛选,获得2株能稳定分泌抗P32蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为2B4和2E10。IFA结果显示,这两株单抗均能与感染GTPV的Vero细胞反应产生特异性荧光;Western-blot试验结果则显示,2B4和2E10能与病毒蛋白反应;这两株单抗与实验室分离保存的2株ORFV均不反应。因此,基于这两株单抗可建立快速敏感的抗原检测方法。
[Abstract]:The results showed that the recombinant P32 - His fusion protein could be used to prepare polyclonal antibody against GTPV . The results showed that the recombinant P32 protein could be used to prepare polyclonal antibody against GTPV . The spleen cells of immunized mice were fused with SP2 / 0 . Two hybridoma cell lines secreting anti - P32 protein antibodies were screened by indirect ELISA and IFA . The results showed that both monoclonal antibodies could react with Vero cells infected with GTPV . The results of Western - blot showed that both monoclonal antibodies and 2E10 could react with viral proteins .

【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.654

【参考文献】