布鲁氏菌TCS TceSR和TcfSR的蛋白组学和转录组学分析

发布时间：2018-04-13 17:36

  本文选题：布鲁氏菌 + TCS　； 参考：《石河子大学》2017年硕士论文

【摘要】：布鲁氏菌(Brucella)和人苍白杆菌(O.anthropi)亲缘关系很亲密,都属于Proteobacteria类的α-2亚类。但是致病能力却相差很大,布鲁氏菌是一种可引起人兽共患的强致病菌,能够对全世界范围内的公共卫生安全造成严重的危害;而人苍白杆菌是一种条件性致病菌,对人类的危害较小。二元调控系统(Two-component systems,TCS)是广泛存在于细菌中的一类重要的毒力调控系统,可以通过感应和处理环境信号来发挥其调控作用。该系统由组氨酸蛋白激酶(histidine protein kinase,HK)和反应调控子(response-regulator protein,RR)组成。比较基因组学发现,布鲁氏菌和苍白杆菌在基因组序列上差异较小,TCS是他们的主要差异之一。在苍白杆菌中缺少布鲁氏菌染色体II上的二元调控系统TceSR和TcfSR。先前研究表明位于染色体I上的12对TCS能够调控布鲁氏菌的能量代谢和转运、生物大分子合成、细菌分裂以及细菌生存繁殖等与布鲁氏菌毒力密切相关的基因,但位于染色体II上的的二元调控系统TceSR和TcfSR毒力表型和致病机制尚不清楚。本研究以突变株16M△TceSR和16M△TcfSR为研究对象,通过对其转录组测序和比较蛋白组研究的分析,揭示由二元调控系统TceSR和TcfSR调控的布鲁氏菌的致病基因和致病性蛋白,为布鲁氏菌的致病机制的研究和开发有效的治疗药物及疫苗奠定基础。目的:本研究以羊种布鲁氏菌亲本株16M和突变株16M△TceSR和16M△TcfSR为研究对象,体外模拟巨噬细胞内的环境,找出TCS TceSR和TcfSR体外高效表达的条件,在此条件下培养亲本株株16M和突变株16M△TceSR和16M△TcfSR,通过转录组学和比较蛋白组学研究深入探讨TCS TceSR和TcfSR在布鲁氏菌中的调控网络及其与布鲁氏菌致病性的关系,以期解释TCS TceSR和TcfSR感受和处理环境信号后如何调控靶基因转录和靶蛋白的表达,从而促进布鲁氏菌的生存。通过本实验的研究为布鲁氏菌的致病机制提供重要的信息。方法:(1)体外模拟细菌在巨噬细胞内的环境,先将亲本株16M在TSB中培养至对数生长期,收菌重悬于高盐、低p H、高温、营养缺乏等环境压力下刺激0.5h,收菌提RNA,反转录成c DNA。针对Tce S、Tce R、Tcf S、Tcf R四个基因设计引物利用q RT-PCR技术确定最佳刺激条件。确定了最佳的刺激条件以后,将细菌在该条件下刺激不同的时间(0.5h、l.5h、3h、4.5h、6h),提取细菌RNA,反转录成c DNA后进行实时定量PCR检测,确定最佳刺激时间。(2)在体外表达最佳条件中培养亲本株16M和突变株16M△TceSR和16M△TcfSR,制备全菌样品样品。采用Label-free技术,并结合生物信息学分析,筛选出在缺失株和亲本株中差异表达的蛋白,以期揭示TCS TceSR和TcfSR在布鲁氏菌中的调控网络与致病性的关系。(3)在体外表达最佳环境中培养亲本株16M和缺失株16M△TceSR和16M△TcfSR,培养至最佳时间点时,收集菌体,提取RNA,采用RNA-seq技术,并结合生物信息学分析,筛选出在突变株和亲本株中差异表达的基因,以期揭示TCS TceSR和TcfSR在布鲁氏菌中的调控网络与致病性的关系。结果:(1)通过体外模拟巨噬细胞内的环境,利用q RT-PCR方法确定了细胞在营养缺乏、p H值为4的情况下刺激3h时,Tce S、Tce R、Tcf S、Tcf R四个基因的表达量均是最高。因此将体外高效表达的条件确定为GEM4.0中刺激3h。(2)比较蛋白质组结果显示:在亲本株16M和突变株16M△TceSR中共有465个蛋白的表达发生了变化,差异表达倍数在2以上的有257个。在突变株16M△TceSR差异表达倍数在两倍以上的下调蛋白共有147个,上调蛋白共110个。这些发生表达变化的蛋白主要是与碳氮代谢、二元调控系统、细胞分裂、热休克蛋白、外膜蛋白、氧化磷酸化、ABC转运子和转录相关的蛋白。在亲本株16M和16M△TcfSR中共有137个蛋白的表达发生变化,在这些差异表达的蛋白中我们选取差异表达倍数两倍以上的作为差异表达蛋白的研究对象,共86个,其中在突变株16M△TcfSR中表达上调的有44个,表达下调的有42个。这些差异表达的蛋白主要与布鲁氏菌的代谢、氧化磷酸化、膜转运、IV型分泌系统、转录和蛋白质运输和RNA降解相关。(3)转录组结果显示:在16M和16M△TceSR中的每个菌株中共检测了3121个基因,与16M相比,在16M△TceSR中共有331个基因的表达发生了显著的变化,其中有137个基因在突变株中显著的下降,194个基因的表达发生了上调(p0.05)。在这些差异表达的基因主要涉及二元调控系统,碳氮代谢、氧化磷酸化、ABC转运系统、核糖体合成相关基因、脂多糖和分泌系统等。在16M和16M△TcfSR中的每个菌株中共检测了3117个基因,与16M相比,在16M△TcfSR中共有342个基因的表达发生了显著的变化,其中有177个基因在突变株中显著的下降,165个基因的表达发生了上调(p0.05)。在这些差异表达的基因主要涉及核糖体大小亚基组成相关的基因、碳代谢、氧化磷酸化、细菌分泌系统、脂肪酸合成、ABC转运系统、氨基酸代谢、嘌呤、嘧啶代谢和DNA复制、修复以及RNA降解、TCS等。结论:(1)TCS TceSR和TcfSR体外高效表达的条件均为GEM4.0中刺激3h;(2)全菌蛋白label-free技术和转录组测序结果表明两个缺失株和亲本株相比,都有很多蛋白和基因的表达都发生了变化,说明TCS TceSR和TcfSR在布鲁氏菌内均有有一个复杂的调控网络,从而使布鲁氏菌适应各种复杂的环境。通过本课题的研究,对TCS TceSR和TcfSR在布鲁氏菌胞内生存中和其调控的的分子机制有一个初步的了解,为深入研究TCS TceSR和TcfSR与布鲁氏菌胞的生存和致病性提供了重要线索。
[Abstract]:Two - component systems ( TceSR ) and 16M 鈻，

本文编号：1745538