车前草多糖对小鼠巨噬细胞免疫功能的调节作用及机制的研究

发布时间：2018-04-26 00:37

本文选题：车前草多糖 + 巨噬细胞　；参考：《西南大学》2017年硕士论文

【摘要】：车前草是由《中华人民共和国药典》收载的一味常用中草药。研究发现,从车前草提取纯化得到的一类多糖类物质——车前草多糖(Plantago asiatica Polysaccharide,PLP)具有清除体内自由基、调节细胞自噬等多种生物学活性。我们的前期研究发现,PLP可提高雏鸡新城疫疫苗免疫效价和雏鸡淋巴细胞转化率。一些研究发现,巨噬细胞可通过其表面受体,如Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)、甘露糖受体(Mannose receptor,MR)、补体3受体(Complement receptor 3,CR3)和β-葡聚糖受体(Dectin-1)等识别多糖,激活核转录因子kappa B(Nuclear factor kappa B,NF-κB)和促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinases,MAP激酶,MAPK)信号通路,促进巨噬细胞分泌细胞因子和一氧化氮(Nitric oxide,NO),提高其吞噬功能,从而达到免疫调节作用。车前草多糖作为一种重要的中药多糖其对固有免疫的作用及其作用机制鲜有报道。本试验以小鼠巨噬细胞为研究对象,运用细胞和分子生物学技术,研究PLP对巨噬细胞免疫功能的调节作用及其作用机制。试验结果如下:1.车前草多糖对巨噬细胞免疫功能的影响本试验用不同浓度(20、40、60、80、100、120、160μg/m L)的PLP与巨噬细胞共培养,并设脂多糖(LPS)对照组(1μg/m L)和空白对照组(只有细胞不加药物),每组3个重复。PLP或LPS与巨噬细胞共培养后,收集细胞上清液检测NO、IL-6和TNF-α含量;收集细胞,提取总RNA检测诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,i NOS)m RNA表达量;加入中性红,检测各组巨噬细胞吞噬中性红活力;加入MTS检测各组巨噬细胞增殖能力。结果显示,PLP 20、40、60、80、100、120μg/m L和LPS(1μg/m L)可显著提高巨噬细胞对中性红的吞噬率、促进巨噬细胞分泌NO和显著提高巨噬细胞i NOS m RNA的表达量(P0.01);PLP 20、40、80和160μg/m L均能显著提高巨噬细胞IL-6分泌量(P0.01);PLP 20、40、80和160μg/m L均能提高巨噬细胞TNF-α分泌量,除20μg/m L剂量组外,均显著高于对照组(P0.01);20、40、60、80、100、120μg/m L PLP均能显著提高小鼠巨噬细胞的增殖率,当PLP为100μg/m L时,增殖率达到峰值,为133.2±7.7%,随后降低。以上结果表明PLP可促进巨噬细胞分泌NO、IL-6和TNF-α,提高巨噬细胞吞噬中性红和增殖的能力,提示PLP具有调节巨噬细胞免疫功能的作用。2.车前草多糖对巨噬细胞免疫调节的作用机制为进一步研究车前草多糖(PLP)调节巨噬细胞免疫功能的机制,本试验检测TLR2/4受体在巨噬细胞识别PLP中的作用,并研究PLP对巨噬细胞NF-κB和MAPK信号通路的影响,在阻断TLR2受体和MAPK条件下观察NF-κB和MAPK两条信号通路在PLP调节巨噬细胞免疫功能中的作用关系。试验用PLP(50μg/m L)与巨噬细胞共培养,并在不同时间点收集细胞和培养上清液,用荧光定量PCR和Western-blot法检测TLR-NF-κB和MAPK信号通路相关基因m RNA表达水平和蛋白表达量;以TLR2抗体(anti-TLR2)和P-ERK阻断剂(U120)分别阻断TLR2和P-ERK表达,检测巨噬细胞相应基因m RNA和蛋白表达水平,以及巨噬细胞分泌TNF-α的变化情况。试验结果显示,PLP刺激巨噬细胞5 h,TLR2和TLR4的m RNA表达量均显著升高(P0.01),且随着PLP刺激时间推移表达量降低,用TLR2抗体阻断TLR2后,anti-TLR2(25μg/m L)+PLP组TLR2/4m RNA表达水平分别为1.88±0.18和0.91±0.23较PLP组显著降低;anti-TLR2(10μg/m L)+PLP和anti-TLR2(25μg/m L)+PLP组TNF-α浓度较PLP组均显著下降(P0.01),anti-TLR2(10和25μg/m L)处理巨噬细胞后,PLP不能提高巨噬细胞TNF-α分泌量;PLP刺激巨噬细胞后其NF-κB和My D88的m RNA表达量较对照组显著升高(P0.01),当TLR2被阻断后,NF-κB和My D88 m RNA的表达量较PLP组均显著下调(P0.01);Western-blot结果显示,PLP刺激巨噬细胞15 min和30 min后,其P65蛋白表达量显著上调,在1 h后P65蛋白随即降低至正常水平;ERK1、JNK1和P38m RNA表达水平在PLP刺激后显著升高(P0.05),ERK2和JNK2 m RNA表达水平与对照组无显著性差异(P0.05);用anti-TLR2阻断巨噬细胞TLR2后,PLP不能引起MAPK三条通路各亚基m RNA表达水平升高;与对照组相比,PLP刺激15 min和30 min后,巨噬细胞ERK1和P-ERK1/2蛋白表达水平均显著升高,ERK2蛋白表达水平没有显著变化,并随着时间推移而降低;同时经P-ERK抑制剂U120处理后,PLP刺激巨噬细胞30 min后不能引起其P-ERK1/2磷酸化水平的升高;经P-ERK抑制剂处理后,PLP不能提高NF-κB和My D88 m RNA表达量,同时也不能提高巨噬细胞NF-κB P65蛋白表达水平,且较PLP处理组差异极显著(P0.01);当用anti-TLR2和U120分别处理细胞后,PLP诱导的i NOS m RNA表达量显著降低(P0.01),但仍显著高于对照组(P0.01)。试验结果提示,巨噬细胞细胞对PLP识别的主要受体是TLR2;TLR2-My D88-MAPK-NF-κB信号通路是PLP作用于巨噬细胞的通路之一;MAPK通路可能参与PLP调节巨噬细胞i NOS的表达。上述结果表明,车前草多糖可通过TLR2-MyD88-MAPK-NF-κB信号通路提高巨噬细胞分泌、吞噬和增殖能力从而调节巨噬细胞免疫功能;并且可以提高巨噬细胞ERK1、JNK1、P38和NF-κB蛋白和m RNA表达,提示ERK1、JNK1、P38和NF-κB为车前草多糖的药理作用靶点。
[Abstract]:In this study , it was found that a kind of polysaccharides , such as Toll - like receptor ( TLR ) , mannose receptor ( MR ) , complement receptor 3 ( CR3 ) and 尾 - glucan receptor ( Dectin - 1 ) , could enhance the immune function of chickens . The expression of TNF - 伪 in macrophages was significantly increased . The results showed that the expression of TNF - 伪 in macrophages was significantly higher than that of control group ( P0.01 ) . After treatment with anti - TLR2 ( 10 渭g / ml ) , the expression levels of NF - 魏B and mRNA were significantly higher than those in the control group ( P0.01 ) . The results showed that TLR2 - MyD88 - MAPK - NF - 魏B signaling pathway was one of the pathways to regulate the secretion , phagocytosis and proliferation of macrophages . The results suggested that the TLR2 - MyD88 - MAPK - NF - 魏B signaling pathway was one of the pathways to regulate the secretion , phagocytosis and proliferation of macrophages . The results suggested that the TLR2 - MyD88 - MAPK - NF - 魏B signaling pathway could increase the immune function of macrophages .

【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S853.74

【参考文献】