表达猪细小病毒VP2基因的重组伪狂犬病病毒构建及其特性研究

发布时间：2018-04-27 18:39

  本文选题：PRV变异株 + 猪细小病毒　； 参考：《华中农业大学》2017年硕士论文

【摘要】：猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)和伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)是影响养猪业生产的重要病原,两者均可引起母猪的繁殖障碍疾病,出现如发情延迟,流产,产死胎、木乃伊胎、弱仔等症状。本研究以PRV基因工程弱毒株rPRVSMX为载体,构建了表达PPV VP2基因的重组伪狂犬病病毒(rPRVSMX-VP2)。通过一系列实验研究重组毒株的生物学特性和免疫原性,以期为PPV和PRV二联基因工程疫苗的研发奠定基础,为临床简化疫苗免疫程序,提高生产效率提供产品。主要研究内容如下:1.PPV毒株的筛选和VP2基因的克隆本研究选取本实验室保存的8株PPV毒株,接种ST细胞后出现明显的细胞病变,表现为细胞拉网、变圆脱落。PCR扩增8株病毒的VP2基因,并进行测序。使用Bio Edit和MEGA软件对VP2蛋白氨基端序列进行生物信息学分析。结果发现:不同分离株的VP2蛋白氨基酸同源性较高,仅有个别氨基酸位点存在差异,不同国家PPV毒株的变异位点不同,国内分离毒株相似性更高。而分析国内分离的病毒,这些毒株VP2基因的变异和其所处的地区也可能有一定的关系。进化树分析显示PPV共分4个亚型,除了HL株是与德国株相近的基因亚型,其他中国分离株均属于基因亚型I,本研究选择分离自湖北武汉的JB株来进行VP2基因的克隆。2.重组毒株rPRVSMX-VP2的构建以pcDNA3.1(+)为骨架,分别插入PRV TK基因上下游同源臂和VP2表达盒基因,构建转移质粒pc DNA3.1-LR-VP2;PRV亲本的缺失毒株rPRVSMX由本实验室胡睿铭博士构建。将线性化的重组质粒pc DNA3.1-LR-VP2和rPRVSMX基因组DNA采用脂质体法共转染PK-15细胞,待细胞病变后收毒。在PK-15细胞上通过5轮空斑纯化筛选出不带荧光的重组病毒rPRVSMX-VP2,通过PCR鉴定和目的片段的测序证明了rPRVSMX-VP2构建成功并纯化。3.重组毒株rPRVSMX-VP2的特性研究将rPRVSMX-VP2接种PK-15细胞,进行Western Blot试验,在rPRVSMX-VP2的泳道中可以观察到一条约64k D大小特异性条带,但在对照载体毒rPRVSMX和PK-15细胞泳道中却没有。IFA试验显示,接种rPRVSMX-VP2的样品中病变的细胞中可以观察到特异性绿色荧光。Western Blot和IFA试验均证明rPRVSMX-VP2在细胞中成功表达了VP2蛋白。将重组病毒以MOI为1接种PK-15细胞,每隔4h进行收毒,至接毒后40h,测定每个时间点的病毒滴度,结果证明重组毒株rPRVSMX-VP2的增殖特性和载体毒一致,无显著性差异,且在接毒后32h,其最高毒价可以达到108.2TCID50/ml。4.重组毒株rPRVSMX-VP2在小鼠上的免疫原性试验小鼠安全性试验证明rPRVSMX-VP2对小鼠是安全的,以10TCID50的滴度接种小鼠足垫也不会导致小鼠死亡。将rPRVSMX-VP2以106.0TCID50的滴度接种小鼠,14d后进行加强免疫,结果表明:rPRVSMX-VP2可诱导小鼠产生与载体毒相当水平的PRV抗体;而在一免后40d,其所诱导产生的PPV血凝抑制抗体(HI抗体)可达到1:27,低于PPV商品化疫苗。5.重组毒株rPRVSMX-VP2在猪上的免疫原性试验猪的免疫原性试验结果与小鼠试验相似,将rPRVSMX-VP2和rPRVSMX以107.0TCID50的滴度接种实验猪,一免后21d加强免疫一次。一免后,rPRVSMX-VP2组和rPRVSMX组的PRV中和抗体水平迅速升高,35d时分别可达到1:23.27±6.92和1:24.87±5.20,无显著性差异;而两组的g B-ELISA抗体在免疫后35d和56d也保持相近的水平。rPRVSMX-VP2所产生的PPV抗体略低于商品化灭活疫苗,一免后ELISA抗体和HI抗体都开始增长,至免疫后56d时,rPRVSMX-VP2组PPV HI抗体为1:192±73.9,低于PPV商品化灭活疫苗免疫后所产生的HI抗体(1:320±128)。
[Abstract]:Porcine parvovirus ( PPV ) and pseudorabies virus ( PRV ) were important pathogens affecting the production of VP2 gene . The results showed that the VP2 gene of VP2 gene was constructed by using the recombinant plasmid pcDNA 3.1 - LR - VP2 and rPRVSMX . The results showed that rPRVSMX - VP2 was safe to mice . The results showed that rPRVSMX - VP2 was safe to mice . The results showed that rPRVSMX - VP2 was safe to mice .

【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.65

【参考文献】

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本文编号：1811852