地克珠利对柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶特性的影响研究

发布时间：2018-04-27 21:46

本文选题：柔嫩艾美耳球虫 + 地克珠利　；参考：《中国农业科学院》2015年硕士论文

【摘要】：柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella,Et)是隶属于顶器复合门(Apicomplexa)艾美耳属的一种胞内寄生性原虫,可引起鸡急性盲肠球虫病,严重时可致鸡只死亡。目前球虫病的控制主要依赖抗球虫药物预防。地克珠利是一种三嗪类化合物,具有高效、低毒、广谱的抗球虫效力,但若长期使用或使用不当,会出现耐药性。要防止或延缓耐药性的发生,以及研制新的有效药物,就必须了解该药抗寄生虫的分子作用机制,确定其靶标分子。至今,关于地克珠利抗球虫的分子作用机制还不清楚。乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)是糖酵解途径的末端酶,能够催化丙酮酸与乳酸之间可逆的氧化还原反应,大多数体内寄生虫依靠此途径获取能量维持生存。研究表明,E.tenella地克珠利敏感株LDH(s Et LDH)与耐药株LDH(r Et LDH)的同工酶谱存在明显差异,提示Et LDH与地克珠利抗球虫作用机理存在一定联系。本研究通过s Et LDH与r Et LDH特性的差异比较、地克珠利对E.tenella孢子生殖及裂殖生殖过程中LDH的影响研究,为揭示地克珠利的分子作用机理及寻找潜在的药物靶标奠定了重要基础。1.Et LDH单克隆抗体的制备及其在蛋白定位中的应用用大肠杆菌表达的重组Et LDH可溶性蛋白免疫BALB/c小鼠,经5次免疫后取脾脏制备免疫脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,经3次亚克隆后获得2株能稳定分泌Et LDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株2F7和2H4,抗体亚类鉴定均为Ig G1,腹水效价分别为1:8 000和1:64 000。Western blot检测显示2F7单抗能识别E.tenella第二代裂殖子中大小约为35 KDa的天然蛋白,利用该单抗对Et LDH在E.tenella第二代裂殖子中的分布进行定位,结果显示Et LDH主要分布于裂殖子的细胞质。研究表明成功制备了Et LDH单克隆抗体,为深入研究Et LDH的功能和特性奠定了基础。2.柔嫩艾美耳球虫地克珠利敏感株与耐药株LDH特性的差异研究克隆r Et LDH蛋白编码区(Coding sequence,CDS),经测序和生物信息学分析,r Et LDH CDS为996 bp,编码331个氨基酸,与s Et LDH仅在第914位有1个碱基的差异,编码蛋白仅在第305位有1个氨基酸的差异;荧光定量PCR结果显示,在球虫4个不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子)中,r Et LDH m RNA的相对含量在子孢子阶段最高,且每个阶段中s Et LDH m RNA的相对含量都明显高于相应的r Et LDH(P0.01);Western blot结果表明,r Et LDH蛋白在第二代裂殖子阶段的相对表达量比s Et LDH下降了55.32%(P0.01);建立了Et LDH催化反应体系,正、逆反应的最适温度分别是50℃、40℃,最适p H分别为6.00、7.00,r Et LDH在孢子化卵囊的催化活力是s Et LDH的78.66%(P0.01)。结果表明,长期的药物诱导使Et LDH的特性发生了改变,地克珠利的作用机理可能与LDH参与的糖酵解途径有关。3.地克珠利对柔嫩艾美耳球虫孢子生殖过程LDH的影响研究将纯化的未孢子化卵囊平均分成两组,药物组用1×10-6地克珠利溶液悬浮后4℃孵育12 h,对照组用等体积溶剂做相同处理。离心洗涤后,各组卵囊进行孢子化培养72 h。孢子化实验结果显示药物组卵囊的孢子化率为对照组的66.32%(P0.01);酶活力测定结果显示药物组Et LDH氧化反应催化活力为对照组的44.39%(P0.01),而还原反应催化活力为对照组的115.76%(P0.01);荧光定量PCR结果显示药物组Et LDH基因的转录水平为对照组的59.18%(P0.01);Western blot结果显示药物组Et LDH蛋白的翻译水平为对照组的80.39%(P0.05)。推测地克珠利通过抑制糖酵解途径中LDH的基因表达及酶活力来抑制球虫的孢子生殖。4.地克珠利对柔嫩艾美耳球虫裂殖生殖过程LDH的影响研究将新鲜的孢子化卵囊接种2周龄无球虫鸡,并分为药物组和对照组。接种后第4 d,药物组按1 mg/kg体重的剂量嗉囊灌服地克珠利溶液,对照组嗉囊灌服相同剂量的药物溶剂,继续正常饮水采食。收集纯化第二代裂殖子,酶活力测定结果显示药物组Et LDH氧化反应催化活力为对照组的37.66%(P0.01),而还原反应催化活力为对照组的52.01%(P0.05);荧光定量PCR结果显示药物组Et LDH基因的转录水平为对照组的21.15%(P0.01);Western blot结果显示药物组Et LDH蛋白的翻译水平为对照组的42.27%(P0.01);间接免疫荧光实验显示药物使Et LDH在细胞质中的分布范围缩小。推测Et LDH是地克珠利的一种潜在药物靶标。
[Abstract]:In order to prevent or delay the occurrence of drug resistance and to develop new effective drugs , it is necessary to understand the molecular mechanism of the anti - parasite of E . tenella and to find potential drug targets . The results showed that the relative content of r Et LDH m RNA was higher than that of the corresponding r Et LDH ( P0.01 ) . The results showed that the relative content of r Et LDH m RNA was higher than that of the corresponding r Et LDH ( P0.01 ) . The results showed that the relative expression of the r Et LDH protein in the second generation merozoite stage was higher than that of the corresponding r Et LDH ( P0.01 ) . The results of Western blot showed that the activity of Et LDH in the drug group was 42.27 % in the control group ( P0.01 ) . The results of Western blot showed that the activity of Et LDH in the drug group was 42.27 % in the control group ( P0.01 ) . The results of Western blot showed that the activity of Et LDH in the drug group was 42.27 % in the control group ( P0.01 ) .

【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.31

【参考文献】