锰对原代培养鸡胚心肌细胞的抗热应激效应及其分子机制研究

发布时间：2018-05-03 01:37

  本文选题：热应激 + 锰　； 参考：《甘肃农业大学》2017年博士论文

【摘要】：本论文以原代培养肉鸡鸡胚心肌细胞为模型进行了五个体外试验,研究锰对鸡胚心肌细胞的抗热应激效应及其分子机制,为缓解热应激对肉鸡等家禽的负面影响提供系统、深入的科学理论依据。试验一:构建原代鸡胚心肌细胞模型并测定心肌细胞持续活力。运用细胞培养技术、通过显微镜观察细胞形态以及经免疫组化鉴定心肌细胞,成功构建了原代鸡胚心肌细胞模型。通过测定细胞培养液中的酶活力,间接评价鸡胚心肌细胞活力,为后续试验提供活力较好且稳定的细胞模型奠定基础。模型构建方面,鸡胚心肌组织用0.12%胶原酶II 37℃消化8 min,800 r/min离心5 min分离细胞,收集细胞并用培养液重悬,经2次差速贴壁纯化后的心肌细胞接种在6孔培养板上,并在40℃、95%空气和5%CO2条件下培养。培养的原代鸡胚心肌细胞生长快速、活跃,培养24 h后可观察到心肌细胞有明显的自律性搏动,72 h后达到95%的汇合,可作为研究鸡胚心肌细胞体外模型。心肌细胞持续活力测定方面,细胞培养液中的肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)和谷草转氨酶(AST)酶活均受到培养时间的影响(P0.05)。CK和LDH酶活有着相似的趋势,在第6天酶活最低,之后逐渐升高。AST酶活随培养时间的延长而增加且在第9天达到最大。心肌细胞的活力可持续6天,之后酶活随培养时间的延长而降低。试验二:研究热应激对原代培养鸡胚心肌细胞的影响,旨在确定原代培养鸡胚心肌细胞受到热应激影响的最佳时间点。采用2×5两因子完全随机设计。试验设2个培养温度(40℃常温和44℃高温)和5个作用时间(1、2、4、6和8 h),共10个处理,每个处理6个重复。在高温条件下,鸡胚心肌细胞培养液中CK、LDH和AST的酶活性显著(P0.05)升高,表明心肌细胞结构的完整性发生了改变。在高温条件下,与常温相比,高温极显著的(P0.05)上调了心肌细胞HSF1、HSF2 mRNA、HSP70和HSP90基因表达。心肌细胞中HSP70和HSP90 mRNA的表达先升高、后降低,且分别在2 h和4 h时达到最大。HSP70和HSP90蛋白表达随热应激时间的延长而升高。面对高温热应激,心肌细胞HSP70和HSP90 mRNA比其相应的蛋白表达反应更灵敏。以上结果表明,HSP70和HSP90基因在体外培养原代鸡胚心肌细胞内的表达对热应激敏感,在鸡胚心肌细胞对抗或缓解热应激损伤中发挥重要作用。最后,热应激处理2 h和4 h为心肌细胞最佳热应激持续时间点,为后续试验四热应激处理时间点提供了试验依据。试验三:研究锰水平对原代培养鸡胚心肌细胞mnsod活性及其基因表达的影响,旨在确定原代培养鸡胚心肌细胞最佳锰加添水平及孵育时间。采用5×3两因子完全随机试验设计,设5个锰添加水平(0、0.5、1、2和4mm氯化锰形态的锰)与3个锰孵育时间(12、24和48h),共15个处理,每个处理6个重复。锰水平和孵育时间对鸡胚心肌细胞mnsod酶活有极显著的互作效应(p0.05)。在12h时,锰水平对mnsod酶活性没有影响(p0.05),而在24h和48h时,与对照组和0.5mmmn相比,1mmmn显著提高了mnsod酶活性(p0.05)。mnsodmrna表达水平上,锰和孵育时间均提高了mnsodmrna基因的表达(p0.05)。与对照组相比,添加1mm锰显著(p0.05)提高了心肌细胞mnsodmrna表达。与作用12h相比,作用24和48h均上调了(p0.05)mnsodmrna基因的表达。以上结果表明,在鸡胚心肌细胞中,锰诱导的mnsod基因表达的调控可能发生在转录和翻译后水平,或者通过修饰合成的mrna和蛋白的稳定性而发挥作用。结合上述结果,选取1mm锰添加水平并孵育48h,为试验四心肌细胞锰处理浓度和孵育时间提供了试验依据。试验四:研究锰对原代培养鸡胚心肌细胞的抗氧化性能及热休克蛋白/因子的影响,以揭示锰对鸡胚心肌细胞的抗热应激效应及其分子机制。试验采用2×3×2三因子完全随机设计。设2个鸡胚心肌细胞培养温度(40℃常温和44℃高温)、3个锰处理(不添加锰、添加1.0mm氯化锰形态的锰以及1.0mm中等络合强度有机锰形态的锰)与2个热应激处理时间点(2h与4h),共12个处理,每个处理6个重复。高温热应激显著提高了(p0.05)心肌细胞mnsod酶活,mnsod、hsp70、hsp90、hsf1、hsf2和hsf3mrna表达,hsp70蛋白表达,表明热应激引起了心肌细胞氧化损伤。与对照组相比,细胞培养液中加无机锰和有机锰均提高了(p0.05)心肌细胞mnsod酶活性,且有机锰显著的(p0.05)高于无机锰。在mnsod基因表达方面,锰源与培养温度有极显著(p0.05)的互作效应。在常温条件下,无机锰和有机锰均提高了(p0.05)心肌细胞mnsod基因表达。在高温热应激条件下,与对照组和无机锰组相比,有机锰显著的(p0.05)上调了心肌细胞mnsodmrna表达。加锰特别是有机锰显著的(p0.05)增加了mnsod蛋白表达。锰源与培养温度的交互作用显著的(p0.05)影响了hsp70基因的表达和hsp90mrna表达。在常温条件下,锰对hsp70基因表达和hsp90mrna表达无影响(p0.05)。在高温热应激条件下,无机锰和有机锰均下调了(p0.05)hsp70和hsp90mrna表达,且有机锰的下调程度显著(P0.05)高于无机锰。不论无机锰还是有机锰均降低了(P0.05)HSP70蛋白表达。然而,加锰显著地提高了(P0.05)HSP90蛋白表达。以上结果表明,细胞培养液中加锰特别是中等络合强度有机锰可提高心肌细胞抗氧化能力,降低热应激引起的氧化损伤。试验五:研究锰对原代培养鸡胚心肌细胞表观遗传的影响。试验设计同试验四。加无机锰和有机锰均降低了(P0.05)心肌细胞MnSOD和HSP70启动子区DNA甲基化水平,可能与其MnSOD mRNA高表达有关。高温组上调了(P0.05)心肌细胞gga-miR-34c-5p,gga-miR-29c-3p表达,下调了(P0.05)gga-miR-10a-5p,gga-miR-10b-5p,gga-miR-125b-5p表达。无机锰和有机锰均上调了(P0.05)心肌细胞ggamiR-142-5p,gga-miR-34b-5p,gga-miR-34c-5p,gga-miR-29c-3p,gga-mi R-10a-5p,gga-miR-10b-5p,gga-mi R-125b-5p表达。以上结果表明,锰可通过修饰特定基因启动子区DNA甲基化程度以及相应的miRNA表达以调控靶基因的表达及其相关通路来缓解高温应激造成的氧化损伤。综上所述,本研究发现心肌细胞培养液中加锰、特别是中等络合强度有机锰,可提高心肌细胞抗氧化能力,有效缓解热应激引起的氧化损伤,而且锰可引起心肌细胞特定基因启动子区DNA甲基化和miRNA表观遗传变化,并调控相应的功能基因。
[Abstract]:In this paper , we studied the effects of Mn on the myocardial cells of chicken embryo and the mechanism of its molecular mechanism . The results showed that the activity of CK , LDH and AST in the culture medium of chicken embryo increased with the increase of culture time . The results showed that the activity of CK , LDH and AST in the culture medium of chicken embryo increased with the increase of culture time . The effects of manganese on the activity of mnsod and its molecular mechanism were studied . The results showed that the effect of Mn on the activity of mnsod and the time of incubation were studied .

【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S831

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 刘霞,王常勇;新生大鼠心肌细胞的分离和培养[J];西北农林科技大学学报(自然科学版);2005年06期

2 刘俊平,曹鸿国,安志兴,赵慧英,温叶飞,张涌;大鼠心肌细胞体外培养特性研究[J];西北农林科技大学学报(自然科学版);2005年01期

3 吴旭颖;郭亮;;仔猪心肌细胞分离及培养方法研究[J];中国畜牧兽医;2010年03期

4 黄子通,王彤,邱嘉民,马中富;猪外周血淋巴细胞与心肌细胞βAR的相关性研究[J];中国急救医学;2000年08期

5 袁婺洲;张月娟;唐文岘;王俊;李永青;王跃群;朱传炳;杨鸿;吴秀山;Rolf Bodmer;;svp基因在果蝇副心肌细胞生长中的作用(英文)[J];遗传学报;2006年01期

6 陈前锋;郑雪花;;心肌原代细胞培养概述[J];中兽医医药杂志;2014年01期

7 范治斌;杜森;谷文峰;杨群辉;胡建民;;大鼠心肌细胞分离纯化方法的改良[J];上海畜牧兽医通讯;2009年02期

8 魏宗波;苗向阳;杨鸣琦;王富宁;罗绪刚;;雏鸡心肌细胞分离及原代培养[J];中国家禽;2008年12期

9 王焕葆,张素芳,赵增翰,范果仪,谢汝忠;人参茎叶皂甙对不同年龄大白鼠心肌细胞的影响[J];动物学报;1986年02期

10 龚宜超;董雅娟;柏学进;封纪武;李兴芳;刘昌菊;;5-Aza诱导BMSC分化为心肌细胞的分子生物学检测[J];中国农业科学;2009年07期

相关会议论文 前10条

1 张保国;赵萍;张文杰;;钼对培养心肌细胞存活的影响[A];中国营养学会首届微量元素专题讨论会论文摘要汇编[C];1985年

2 房亚东;黄跃生;党永明;张家平;张东霞;宋华培;张琼;;上调微管相关蛋白4对缺氧早期心肌细胞活力影响的实验研究[A];中华医学会烧伤外科学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年

3 唐陶;王世骐;庄茁;;基底应变对心肌细胞的影响[A];北京力学会第14届学术年会论文集[C];2008年

4 何作云;刘健;王培勇;;心肌细胞核钙信号的研究[A];21世纪医学工程学术研讨会论文摘要汇编[C];2001年

5 何作云;刘健;;心肌细胞核钙信号的研究[A];第九次全国生物物理大会学术会议论文摘要集[C];2002年

6 滕苗;黄跃生;党永明;房亚东;张琼;;微管干预剂对缺氧心肌细胞糖酵解途径关键酶的影响[A];第六届全国烧伤救治专题研讨会论文汇编[C];2009年

7 宋新爱;林元喜;樊小力;;心肌细胞的纯化[A];中国病理生理学会第九届全国代表大会及学术会议论文摘要[C];2010年

8 刘兴茂;陈昭烈;刘红;熊福银;;心肌细胞体外三维培养的初步研究[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年

9 熊江辉;李莹辉;聂捷琳;张晓铀;丁柏;;槲皮素对回转条件下心肌细胞—氧化氮合成的影响[A];中国宇航学会航天医学工程专业委员会、中国空间科学学会空间生命专业委员会联合学术研讨会论文摘要集[C];2001年

10 阳冬梅;吴才宏;程和平;;钙调蛋白对心肌细胞兴奋—收缩耦联的调节作用[A];第九次全国生物物理大会学术会议论文摘要集[C];2002年

相关重要报纸文章 前10条

1 刘黎;荷兰培育心肌细胞取得进展[N];中国中医药报;2008年

2 编译 晓鱼;人类心肌细胞可再生[N];医药经济报;2009年

3 孙国根;心肌细胞的形成和再生有望被诱导[N];中国医药报;2012年

4 吴伟农;心肌细胞能自我修复[N];医药经济报;2001年

5 陈丹;移植的人体细胞可与豚鼠受体心肌同步跳动[N];科技日报;2012年

6 记者胡德荣;心肌细胞能体外培养[N];健康报;2002年

7 杨洋;骨髓细胞生成心肌细胞[N];卫生与生活报;2003年

8 吴理茂 李连达;中药在心肌细胞移植中的作用[N];中国医药报;2003年

9 ;急性心梗治疗获重要突破 心肌细胞可以再生[N];中国保险报;2003年

10 记者 张晔;基因调控让坏死的心肌细胞“复活”[N];科技日报;2011年

相关博士学位论文 前10条

1 吴东栋;硫化氢提高Cu/Zn-SOD和Mn-SOD活性的作用及其机制研究[D];复旦大学;2013年

2 徐磊;MMI-0100通过对心肌细胞及成纤维细胞中MK2的抑制作用降低心肌纤维化程度的研究[D];山东大学;2015年

3 牟永潮;基于纳米材料再造心肌组织生物学评价与心梗治疗研究[D];哈尔滨工业大学;2015年

4 李娜;PDE5抑制剂Sildenafi1对心梗后心衰线粒体能量代谢保护及机制研究[D];第四军医大学;2015年

5 陈亮;miR-199a对大鼠心肌细胞自噬的调控研究[D];第二军医大学;2015年

6 王晓丽;附子人参配伍对大鼠心肌细胞保护作用的研究[D];长春中医药大学;2015年

7 肖剑锋;碘化-N-正丁基氟哌啶醇对缺氧心肌细胞钙稳态的保护作用[D];汕头大学;2011年

8 张翠翠;MG53调节心脏辅助亚基KChIP2表达的分子机制及在心电稳态调节中的作用[D];南方医科大学;2014年

9 张海彬;miR-711在心肌缺血再灌注损伤中的作用机制[D];吉林大学;2016年

10 位庚;心肌微血管内皮细胞损伤对心肌细胞的影响及通络干预研究[D];河北医科大学;2016年

相关硕士学位论文 前10条

1 付丽;硫化氢后处理对大鼠缺氧/复氧心肌细胞的保护作用及机制研究[D];遵义医学院;2015年

2 黄玉洁;miR-218调控小鼠胚胎干细胞体外定向分化心肌细胞研究[D];浙江大学;2015年

3 李品雅;华蟾毒精对心肌细胞L型钙电流，，钙瞬变和收缩力的影响[D];河北医科大学;2015年

4 刘洋;野蔷薇苷对H_2O_2诱导心肌细胞氧化损伤的保护作用及其机制研究[D];河北医科大学;2015年

5 朱燕梅;银杏叶提取物保护心肌细胞抗氧化损伤及其基于Keap1/Nrf2/ARE通路的作用机制[D];成都医学院;2015年

6 刘莉;心肌细胞TLR4促进心梗后心脏炎症反应的研究[D];宁夏医科大学;2015年

7 卢杏;体外转染CyclinA2基因对原代大鼠心肌细胞增殖的影响[D];新乡医学院;2015年

8 窦梦怡;缺氧时心肌细胞自噬的变化及其机理的研究[D];山西医科大学;2015年

9 兰晓东;微管解聚对心肌细胞电生理特性的影响及微管定量分析方法研究[D];第三军医大学;2015年

10 李熠;TGR5在高糖诱导小鼠心肌细胞凋亡中的作用及其机制[D];四川医科大学;2015年

本文编号：1836430