miR-2459调控锌指抗病毒蛋白ZAP的表达对BVDV复制的影响研究

发布时间：2018-05-05 18:57

  本文选题：BVDV + miR-2459　； 参考：《石河子大学》2017年硕士论文

【摘要】：至今为止,有关BVDV导致易感动物感染方面的分子机制还不十分明确,BVDV与被感染宿主的细胞之间存在何种相互关联的机理仍处于探究阶段。故本实验室在前期的研究中使用solexa高通量测序检测了BVDV感染靶细胞MDBK后的miRNA表达谱,结果显示:感染BVDV的MDBK细胞中miR-2459的表达量显著性升高。通过生物信息学预测软件分析发现miR-2459靶向于锌指抗病毒蛋白基因ZAP。在此基础上,本实验研究以miR-2459为研究对象,探究miR-2459如何影响BVDV复制?ZAP在其中发挥何种作用?进而为阐述BVDV的持续性感染和BVDV防控新方法奠定了理论基础。目的:为探究miR-2459促进BVDV复制的分子机制。对实验室BVDV感染的MDBK细胞高通量测序的结果进行了分析,选取了表达量显著性上调的miR-2459来进行后续的研究。方法:⑴BVDV感染MDBK细胞短期后,使用Stem-loop RT-PCR的方法鉴定细胞中miR-2459的表达水平;转染miR-2459模拟物和抑制剂,RT-PCR和Reed-Münch法检测BVDV的复制水平。⑵生物信息学软件预测miR-2459的靶基因;双荧光素酶报告基因实验鉴定miR-2459能直接靶向于ZAP 3’UTR区域;转染miR-2459模拟物和抑制剂,RT-PCR检测miR-2459对ZAP表达的影响;RT-PCR检测BVDV NADL侵染MDBK细胞后靶细胞中ZAP的表达水平。⑶构建ZAP的过表达载体p LEX EGFP-ZAP;在HEK-293细胞上采用钙转的方式包被慢病毒;使用慢病毒侵染MDBK细胞,使用嘌呤霉素在细胞的传代中对细胞不断的筛选,以期获得稳定过表达ZAP的MDBK细胞系;BVDV感染过表达ZAP的MDBK细胞后,RT-PCR和Reed-Münch法测定miR-2459对BVDV复制水平的影响。结果:⑴Stem-loop RT-PCR的方法鉴定得到,BVDV感染MDBK细胞短时间内,细胞内miR-2459的表达水平呈上升趋势;MDBK细胞中转染miR-2459模拟物和抑制剂后,再感染BVDV病毒后,miR-2459对BVDV复制起促进作用。⑵使用生物信息学软件预测到miR-2459的靶基因是抗病毒相关的锌指抗病毒蛋白基因ZAP;双荧光素酶报告基因实验鉴定出miR-2459直接靶向于ZAP的3’UTR区;分别转染miR-2459的模拟物和抑制剂后,miR-2459对ZAP m RNA的表达有抑制作用;BVDV NADL侵染的靶细胞中,ZAP m RNA水平呈下降趋势。⑶成功构建出ZAP过表达载体p LEX EGFP-ZAP;成功包被出慢病毒并获得了稳定过表达ZAP的MDBK细胞系;RT-PCR和Reed-Münch法检测发现过表达ZAP的MDBK细胞对BVDV的复制有极显著地抑制作用。结论:miR-2459直接靶向于锌指蛋白ZAP的3’UTR区域,并影响ZAP的表达水平,从而间接抑制细胞的抗病毒作用,在BVDV的复制过程中发挥促进的作用。
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本文编号：1848904