猪瘟病毒细胞入侵途径及GBF1和Rab2调控其增殖的研究

发布时间：2018-05-08 08:02

  本文选题：猪瘟病毒 + 细胞入侵　； 参考：《西北农林科技大学》2017年博士论文

【摘要】：猪瘟(classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的猪的一种烈性传染病,对养猪业危害很大,被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的动物传染病之一,我国将其列为一类动物疫病。猪瘟病毒(CSFV)为黄病毒科瘟病毒属成员,是一种有囊膜的单股正链RNA病毒。国内外对CSFV的致病机理开展了一系列研究,取得了一些进展,但对CSFV的扩散方式、细胞入侵途径及复制机制等尚不完全清楚。因此,本研究以CSFV感染猪睾丸细胞(Swine testis cell,ST)为模型,针对CSFV在体外培养系统中的传播方式、入侵易感细胞的途径及复制增殖与高尔基体-内质网反式运输调节蛋白GBF1和Rab2的关系开展了研究,获得以下研究结果:1.CSFV随着细胞分裂增殖,低浓度中和抗体不能完全阻断病毒的传播。通过低熔点琼脂糖及中和抗体阻断试验,证明CSFV在体外培养系统中以释放后再感染的方式扩散,未能发现CSFV细胞间直接传播的证据;通过检测不同浓度中和抗体对CSFV扩散限制效果发现,抗体浓度低于1×105ND50时不能阻断CSFV的扩散;通过分析在中和压力下CSFV感染斑块阳性细胞数和细胞倍增时间得知,CSFV能够随着细胞的分裂而增殖。2.CSFV利用网格蛋白介导的内吞途径入侵细胞。用real-time PCR和间接免疫荧光法检测CSFV早期入侵细胞的情况,发现在CSFV感染过程中添加网格蛋白组装抑制剂氯丙嗪和动力蛋白抑制剂dynasore后,细胞内CSFV含量显著下降;通过shRNA干扰载体的构建和细胞转染、筛选,成功构建了网格蛋白重链和Ⅱ型动力蛋白干扰细胞株,通过对比检测CSFV入侵干扰细胞的效率发现,在网格蛋白重链和Ⅱ型动力蛋白表达量下调后,CSFV感染早期胞内CSFV含量显著减少,证明CSFV能够通过网格蛋白介导的内吞途径入侵细胞。3.CSFV入侵细胞依赖初级内体和次级内体。利用氯化铵调节CSFV感染过程中细胞的酸性,通过检测感染早期胞内CSFV含量,发现氯化铵抑制了CSFV入侵细胞的效率,证明CSFV感染需要酸性环境诱导;构建了初级内体标志蛋白Rab5和次级内体标志蛋白Rab7和Rab9的shRNA载体,并通过转染ST细胞和嘌呤霉素筛选得到了干扰细胞株;通过对比检测感染早期CSFV在Rab5、Rab7和Rab9干扰细胞和ST细胞及随机干扰细胞中的含量,证明Rab5、Rab7和Rab9基因下调后CSFV入侵细胞的效率显著下降,说明CSFV入侵细胞对初级内体和次级内体有着依赖性。4.GBF1和Rab2调控CSFV的增殖。利用布雷菲德菌素A和golgicide A抑制GBF1活性,通过real-time PCR和病毒滴度检测发现,CSFV的增殖对GBF1抑制剂较为敏感;通过shRNA干扰得到GBF1、ARF1和Rab2干扰细胞,并对CSFV在此3种细胞及对照细胞上增殖的情况进行检测,结果发现,GBF1和Rab2表达量下调后CSFV的增殖受到了明显抑制,而CSFV在ARF1干扰细胞上的增殖情况与对照组没有显著差异,过表达GBF1和Rab2能够促进CSFV增殖。试验结果表明高尔基体-内质网反式运输调节蛋白GBF1和Rab2能够调控CSFV的增殖,而CSFV增殖并不依赖ARF1蛋白。综上所述,本研究明确了在体外培养系统中CSFV的传播方式、对易感细胞的入侵方式及其依赖的亚细胞结构和蛋白,证明了高尔基体-内质网逆向转运调控蛋白GBF1和Rab2在CSFV增殖中发挥了重要作用,为全面了解CSFV生命周期及复制机制提供了新的理论资料和数据支持。
[Abstract]:Classical swine fever ( CSFV ) is a kind of infectious disease of swine caused by classical swine fever virus ( CSFV ) , which is a kind of animal epidemic disease . The results showed that CSFV inhibited the proliferation of CSFV after downregulated by Rab5 , Rab7 and Rab9 . The results showed that CSFV inhibited the proliferation of CSFV after downregulated by Rab5 , Rab7 and Rab2 .

【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.651

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本文编号：1860608