牛外周血单个核细胞酵母双杂交cDNA文库的构建和鉴定

发布时间：2018-05-22 11:14

  本文选题：牛外周血单个核细胞 + 布氏杆菌病　； 参考：《延边大学》2015年硕士论文

【摘要】：布氏杆菌病(Brucellosis)是一种人畜共患传染病。19世纪末期被人们发现并广泛研究,迄今为止已经有100多年的历史。布氏杆菌病是我国规定的乙类动物疫病,也是目前严重威胁养牛业发展和人类健康的重要疾病之一。酵母双杂交系统是用来研究蛋白质与蛋白质、蛋白质与小分子之间相互作用的实验技术。是通过建立牛外周血单个核细胞的cDNA文库,来筛选与牛布氏杆菌结合的受体蛋白,对布氏杆菌病的预防和控制有重要的意义。本研究预先制备牛外周血单个核细胞,采用Trizol法提取牛外周血单个核细胞的总RNA。利用美国Clontech公司的SMART技术构建牛外周血单个核细胞的酵母双杂交cDNA文库。.将全部的DNA合成cDNA的前端,然后在整个反应中加入SMART Ⅲ Oligo,目的是让cDNA的前端与mRNA形成互补,合成双链cDNA的方法是通过长距离PCR(LD-PCR)。因为双链cDNA与PGADT7-Rec利用酵母细胞内具有非常相似的重组酶活性,进而形成具有复制活性的文库质粒,那么在SD/Leu培养板上筛选出所有克隆。所以用纯化后的双链cDNA与线性化质粒PGADT7-Rec连接,转入酵母细胞Y187感受态中,并用PEG/LiAc的方法完成转化。再次通过稀释的方法计算转化率与文库的容量大小,然后通过菌落PCR的方法检查重组率和插入片段的大小。结果显示,提取的牛外周血单个核细胞的总RNA浓度为1050ng/ul, OD26o/OD280为1.95,后经1%琼脂糖凝胶电泳分析可见28S和18S条带。纯化后双链cDNA的凝胶电泳的方法操作,结果显示片段大小在400-2 500bp之间。鉴定结果表明,本次构建的cDNA文库容量为4.0×108CFU/mL,文库的重组率达到95%以上,平均插入片段的大小为700bp左右。以上实验结果说明本研究建立的cDNA文库的质量非常高,达到了后续实验的要求,为牛布氏杆菌受体的筛选提供了扎实的基础与理论依据。
[Abstract]:Brucellosis (Brucellosis) is a zoonotic infectious disease. It has been widely studied in the late 19th century and has a history of more than 100 years. Brucellosis is one of the most important diseases that threaten the development of cattle industry and human health. Yeast two-hybrid system is used to study the interaction between protein and protein, protein and small molecule. CDNA library of bovine peripheral blood mononuclear cells was established to screen receptor proteins binding to Brucella bovis, which is of great significance for the prevention and control of brucellosis. In this study, bovine peripheral blood mononuclear cells (BPBMC) were prepared and extracted from bovine peripheral blood mononuclear cells (BPBMC) by Trizol method. The yeast two-hybrid cDNA library of bovine peripheral blood mononuclear cells (BPBMC) was constructed by SMART technique of Clontech Company in USA. The front end of cDNA was synthesized from all DNA and then SMART 鈪，

本文编号：1921832