巨型艾美耳球虫Emgam56基因在毕赤酵母中的表达及其免疫保护性研究

发布时间：2018-05-27 22:24

  本文选题：巴斯德毕赤酵母 + 巨型艾美耳球虫　； 参考：《扬州大学》2015年硕士论文

【摘要】：鸡球虫病是由多种艾美耳球虫(Eimeria)寄生于鸡肠道黏膜上皮细胞内所引起的一种寄生原虫病,不仅引起鸡发病死亡,还可严重影响鸡的生长发育,降低饲料报酬。目前鸡球虫病的防治主要依靠化学药物,其次是鸡球虫病活疫苗。随着抗球虫药物的广泛与大量使用,球虫耐药性以及人们对药物残留肉蛋、污染环境等诸多问题也随之出现。同时活球虫疫苗又存在生产成本高、容易扩散病原、容易引起肠炎发生等弊端。为此,亚单位疫苗已成为鸡球虫病疫苗的发展方向。CoxAbic(?)是由巨型艾美耳球虫(E. maxima)配子体蛋白EmGam56、EmGam82和EmGam230组成的一种亚单位疫苗,在其生产过程中需从感染鸡体分离纯化配子体,然后再用亲和柱层析的方法分离纯化配子体蛋白,因此生产费时、成本昂贵。利用基因重组技术研制基因工程疫苗可能解决这一难题。巴斯德毕赤酵母表达系统是一种真核表达系统,不仅具有操作简单、生长速度快、发酵成本低廉等优点,还具有高等真核表达系统的蛋白翻译后的加工修饰功能,该系统所表达产物的免疫学活性和生物学功能与天然蛋白质更为接近。因此,本研究在巴斯德毕赤酵母中表达了E. maxima配子体蛋白Emgam56基因,检测了酵母表达蛋白rEmGam56的抗原特异性和免疫原性,并通过动物免疫保护试验比较分析了酵母表达蛋白rEmGam56和原核表达蛋白rEmGam56对E. maxima的免疫保护效果,为重组配子体抗原亚单位疫苗的研制奠定基础。1.巨型艾美耳球虫Emgam56基因的毕赤酵母表达及其初步鉴定根据Emgam56基因去除信号肽后的ORF序列和真核表达载体pPICzaA的酶切位点设计一对特异性引物,以本实验室保存的重组质粒pGEM-T-Emgam56为模板,PCR扩增出目的片段,插入表达载体pPICzαA中,构建重组表达质粒pPICzaA对酶切鉴定和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序,将连接正确的重组质粒线性化后用电穿孔法转化到毕赤酵母GS115,利用博莱霉素(Zeocin)抗性筛选多拷贝重组菌株,摇瓶水平进行诱导表达,所得蛋白大小约为11.6 kDa,且能被6×HIS单抗识别。2.巨型艾美耳球虫毕赤酵母重组表达蛋白rEmGam56的免疫原性分析分别以鼠抗酵母表达蛋白rEmGam56多克隆抗体、鼠抗原核表达蛋白rEmGam56多克隆抗体和E. maxima鸡康复血清为一抗,对酵母表达蛋白rEmGam56进行Western-blot检测,结果显示该蛋白具有良好的免疫原性。以酵母表达蛋白rEmGam56为抗原,用间接ELISA方法检测鼠抗酵母表达蛋白rEmGam56多抗、原核表达蛋白rEmGam56多抗和鸡康复血清,显示该重组蛋白能刺激机体产生一定的抗体水平,并且能识别鸡康复血清中的特异性抗体。3.巨型艾美耳球虫毕节酵母重组表达蛋白rEmGam56的免疫保护效果以雏鸡为试验动物,以死亡率、相对增重率、病变记分减少率与相对卵囊产量、细胞免疫和体液免疫水平等为评价指标,对酵母表达蛋白rEmGam56的免疫保护效果进行了初步研究,并与原核表达蛋白rEmGam56和卵囊的免疫效果相比较。结果显示：酵母表达蛋白高剂量组(60μg/羽鸡)和原核表达蛋白高剂量组(300 μg/羽鸡)的免疫效果最佳,但都低于卵囊免疫组；其中酵母表达蛋白高剂量组(60μg/羽鸡)的免疫效果略低于原核表达蛋白高剂量组(300μg/羽鸡)。
[Abstract]:The present study is a kind of eukaryotic expression system , which has the advantages of simple operation , high growth speed , low fermentation cost and so on . It has the advantages of simple operation , high growth speed , low fermentation cost and so on . The results showed that the recombinant protein could stimulate the organism to produce a certain antibody level . The results showed that the recombinant protein could stimulate the organism to produce certain antibody level . The results showed that the recombinant protein could stimulate the organism to produce certain antibody level . The results showed that the immune effect of the high dose group ( 60 渭g / feather chicken ) and the high dose group ( 300 渭g / feather chicken ) in the prokaryotic expression protein were the best , but it was lower than that of the immune group of the egg sac .
The immune effect of high - dose group ( 60 渭g / feather ) in yeast expression protein was slightly lower than that of prokaryotic expression protein high - dose group ( 300 渭g / feather chicken ) .
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.7

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本文编号：1944045