绵羊卵丘-卵母细胞复合体石蜡切片技术的改良

发布时间：2018-05-28 01:14

  本文选题：绵羊 + 卵丘-卵母细胞复合体仿组织　； 参考：《中国农业科学》2017年08期

【摘要】：【目的】在绵羊有腔卵泡发育过程中,多层卵丘细胞紧密包绕着卵母细胞形成卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complex,COCs)特殊结构,存在于卵泡腔内。卵泡成熟后,绵羊COC从卵泡内排出,进入输卵管,等待受精。现有的卵丘-卵母细胞复合体蛋白鉴定技术,或者将包含各级卵泡的卵巢组织直接进行切片处理,或者将COCs从卵泡内分离,在完整卵丘-卵母细胞复合体水平上进行免疫染色。但这两种方法在检测绵羊有腔卵泡COCs中目的蛋白表达时,存在显著缺陷。研究旨在对常规石蜡组织切片技术进行改进,以期满足绵羊COCs蛋白鉴定需求。【方法】首先采用抽吸法从绵羊有腔卵泡内获得COCs,以石蜡包埋方式人为构建了一种可以进行切片处理的"包含多枚绵羊卵丘-卵母细胞复合体的仿组织结构"。然后以该特殊结构与健康绵羊卵巢组织为研究对象,分别采用改良与传统的石蜡组织免疫化学技术流程,检测了目的蛋白,尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen activator,uPA)与其受体(urokinase-type plasminogen activator recepter,uPAR),在绵羊COCs中的表达情况,比较了两种技术的免疫染色效果与染色流程差异。【结果】将所构建的绵羊COCs仿组织结构与正常绵羊卵泡组织,进行石蜡组织切片处理,经切片、贴片与脱蜡等步骤,分别形成了散在分布于载玻片上的COCs薄片与包含卵泡的卵巢组织薄层(厚度5μm)。经间接免疫染色处理后,结果显示:①目的蛋白在两种结构COCs中的表达是一致的,即uPAR在绵羊卵丘与卵母细胞上都有表达,而uPA只存在于绵羊卵丘细胞中;②在绵羊COCs薄片结构中,COCs整体形态完好,卵母细胞与外围卵丘细胞层次清晰,蛋白定位清楚,染色效果良好;在卵巢薄层结构中,绵羊卵泡内壁颗粒细胞与COCs等形态结构相对完整,卵母细胞蛋白定位清楚,但是卵丘细胞层次与蛋白表达较不清晰;③与绵羊卵巢组织石蜡切片技术相比较,绵羊COCs仿组织结构石蜡切片技术,在固定、脱水、透明、浸蜡以及脱蜡等步骤的处理时间都大大缩短,例如固定处理由24h缩短为2h;由逐级脱水的10h缩短为两级脱水的1h;透明由30min缩短为10min;软蜡与硬腊浸入由原来的6h缩短为1h;由逐级脱蜡的25min缩短为两级脱蜡的10min等。【结论】改进后的COCs仿组织石蜡切片染色技术,显示更优质的免疫定位与染色效果,不仅具有COCs获得率高、卵母与卵丘细胞形态层次清晰等优点,而且显著缩短了操作时间,简化了操作流程。该技术在保留COCs结构完整的基础上,有效检测了目的蛋白在绵羊卵丘-卵母细胞复合体中的表达模式,对于探明绵羊卵泡发育与卵母细胞成熟机制,具有重要意义。
[Abstract]:[objective] during the development of ovine antral follicles, the multilayer cumulus cells tightly encircle the oocytes to form a special structure of cumulus-oocyte complex COCswhich exists in the follicular cavity. After follicle maturation, COC is excreted from the follicle, enters the fallopian tube and waits for fertilization. The existing techniques for identification of cumulus-oocyte complex proteins can either directly slice the ovarian tissues containing various follicles or separate COCs from the follicles for immunostaining at the level of intact cumulus-oocyte complexes. However, these two methods have significant defects in detecting the expression of target protein in COCs of sheep with antral follicles. The aim of this study was to improve the technique of paraffin tissue section. In order to meet the needs of sheep COCs protein identification. Firstly, the method of aspiration was used to obtain COCs from the ovine follicles, and a paraffin embedded method was used to construct a kind of "sheep cumulus-egg" which can be sliced. The mimic tissue structure of the mother cell complex. Then the specific structure and healthy ovaries of sheep were used to detect the target protein by using the modified and traditional paraffin immunohistochemical technique. Expression of urokinase-type plasminogen activator UPA and its receptor urokinase-type plasminogen activator receptor uPAR in sheep COCs. The immunostaining effect and the dyeing process of the two techniques were compared. [results] the constructed sheep COCs tissue was treated with paraffin tissue sections, and then treated with paraffin sections, patch and dewaxing, and the tissue structure of the constructed sheep follicles was compared with that of the normal sheep follicle tissues, and then treated with paraffin sections, patch and dewaxing. A thin layer of COCs and a thin layer of ovarian tissue containing follicles were formed (thickness 5 渭 m). The results of indirect immunostaining showed that the expression of the target protein was the same in COCs, that is, uPAR was expressed in both ovine cumulus and oocyte, but uPA was only present in sheep cumulus. (2) in the lamellar structure of sheep COCs, the overall morphology was intact, the layers of oocytes and peripheral cumulus cells were clear, the protein location was clear, and the staining effect was good. The morphology and structure of granulosa cells in the inner wall of sheep follicles and COCs were relatively complete, and the protein localization of oocytes was clear, but the level of cumulus cells and the expression of protein were not clear. Sheep COCs tissue structure paraffin section technology, in the process of fixation, dehydration, transparency, wax immersion and dewaxing, the processing time is greatly reduced. For example, fixation treatment shortened from 24 h to 2 h; from step by step dehydration from 10 h to 2 step dehydration; transparency from 30min to 10 min; soft wax and hard wax immersion from 6 h to 1 h; from step by step dewaxing 25min to two stage dewaxing 10min. [conclusion] the improved COCs imitating tissue paraffin section staining technique, The results showed that the improved immunolocalization and staining not only had the advantages of high COCs acquisition rate and clear morphology of oocytes and cumulus cells, but also significantly shortened the operation time and simplified the operation process. On the basis of preserving the structure of COCs, the expression pattern of the target protein in the cumulus oocyte complex of sheep was detected effectively, which is of great significance for the study of the mechanism of ovine follicular development and oocyte maturation.
【作者单位】： 内蒙古农业大学兽医学院;内蒙古医科大学心身医学研究室;
【基金】：国家自然科学基金(31060165,31360283,31660701) 内蒙古自然科学基金(2012MS0411)
【分类号】：S826

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