表达PCV2 ORF2基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建及其免疫保护效力研究

发布时间：2018-06-01 00:07

  本文选题：猪繁殖与呼吸综合征病毒 + 猪圆环病毒2型　； 参考：《南京农业大学》2015年硕士论文

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪圆环病毒2型(Porcinecircovirustype2,PCV2)是目前危害世界养猪业的两种重要病原。本研究利用感染性克隆技术成功构建了能够表达PCV2 ORF2基因的重组PRRSV rTJM/Cap毒株,猪体免疫保护试验证明,rTJM/Cap活疫苗能提供对PCV2的免疫保护。同时,建立了猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体间接ELISA检测方法,为该病新型疫苗和ELISA试剂盒研制奠定了基础。具体内容如下:1.表达PCV2 ORF2基因的重组PRRSV的构建与鉴定本研究采用PCR方法构建PRRSV疫苗株TJM-F92全长cDNA克隆载体pCMV-TJM,并在其ORF7和3'UTR之间插入Afl Ⅱ/Mlu Ⅰ酶切位点和转录调控序列TRS6,构建获得pCMV-TJM-TRS表达载体。将PCV2 ORF2基因插入该载体Afl Ⅱ/MuⅠ 位点,获得重组质粒 pCMV-TJM-Cap。将 pCMV-TJM、pCMV-TJM-TRS和pCMV-TJM-Cap分别转染Marc-145细胞,拯救获得3种重组病毒rTJM、rTJM/TRS和rTJM/Cap。基因测序列、酶切鉴定、Western blot、间接免疫荧光和病毒生长特性结果显示,3种重组PRRSV病毒都含有特征性分子标记,在Marc-145细胞增殖特性与亲本病毒相似;rTJM/Cap传至第8代,仍含有外源Cap基因,病毒感染细胞能有效表达PCV2 Cap蛋白,从而为PRRSV致病机制和PRRSV-PCV2疫苗研究奠定了重要基础。2.表达PCV2 ORF2基因的重组PRRSV对PCV2的免疫保护效力研究本研究选取28-30日龄健康仔猪,采用重组病毒rTJM/Cap毒株活疫苗(106.0TCID50/mL)和rTJM/Cap毒株BEI灭活疫苗,进行免疫保护试验,结果为:仔猪免疫rTJM/Cap活疫苗后能够刺激机体产生高水平的PCV2特异性ELISA抗体和中和抗体,但PCV2细胞免疫反应不明显;攻毒后,rTJM/Cap活疫苗组相对日增重高于攻毒对照组,rTJM/Cap活疫苗能显著降低PCV2病毒血症和淋巴结病毒载量,rTJM/Cap活疫苗组猪临床症状及肺和淋巴结组织病理变化明显明显低于攻毒对照组。rTJM/Cap灭活疫苗免疫组攻毒后PCV2病毒血症、淋巴结组织病变和抗原测定结果与攻毒对照组相似。证明重组病毒rTJM/Cap活疫苗免疫后可以为猪体提供一定的抵御PCV2的保护力,为PCVD新型疫苗研究奠定了基础。3.PRRSV抗体间接ELISA检测方法的建立本研究用差速离心纯化的PRRSV全病毒作为包被抗原,建立了PRRSV间接ELISA抗体检测方法。最佳反应条件是:抗原包被浓度2μg/mL,包被条件为4℃ 12h,用含1%BSA的PBST封闭37℃ 2h,血清反应条件为37℃ 1h,HRP-SPA 1:20000,37℃作用45min,TMB最佳反应条件为37℃避光作用20min。选定标准阴、阳性对照采用S/P比值作为判定标准,S/P0.369,判为阳性,S/P0.276,则判为阴性;S/P介于两者之间判为可疑。该方法与FMDV、CSFV、PRV、PEDV、PCV2阳性血清无交叉反应;批内和批间重复性试验变异系数均低于10%。与IDEXX公司的PRRSV抗体检测试剂盒比较,其敏感性、特异性及符合率分别为100.0%、88.2%和92.7%。证明本方法具有特异性强、重复性好、灵敏度高和符合率高等优点,为PRRSV间接ELISA抗体检测试剂盒研制奠定了基础。
[Abstract]:Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSVV) and Porcine circovirus type 2 (Porcinecircovirustype2 PCV2) are two major pathogens that harm the world pig industry. In this study, a recombinant PRRSV rTJM/Cap strain expressing PCV2 ORF2 gene was successfully constructed by using infectious cloning technique. The porcine body immunity protection test showed that rTJM / Cap live vaccine could provide immunity protection to PCV2. At the same time, the indirect ELISA detection method of porcine reproductive and respiratory syndrome virus antibody was established, which laid a foundation for the development of new vaccine and ELISA kit. The details are as follows: 1. Construction and Identification of Recombinant PRRSV expressing PCV2 ORF2 Gene; in this study, the full-length cDNA clone vector pCMV-TJM of PRRSV vaccine strain TJM-F92 was constructed by PCR method, and Afl 鈪，

本文编号：1961953