鸡柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原AMA1蛋白亲和肽筛选及其抗球虫作用研究

发布时间：2018-06-02 13:07

  本文选题：鸡 + 柔嫩艾美耳球虫　； 参考：《东北农业大学》2017年硕士论文

【摘要】：鸡球虫是严重危害养禽业的病原体之一,导致养禽业经济损失巨大。尽管饲料添加药物的方式对球虫病的防控发挥了重要的保障作用,但随着鸡球虫抗药性、药物残留等一系列问题的产生,迫切需要寻找新的药物靶标分子从而开发新型药物。对疟原虫和弓形虫等寄生原虫的研究已经表明,顶复门原虫的顶膜抗原1(AMA1)是颇具应用前景的药物靶标。疟原虫、弓形虫等在侵入宿主细胞的过程中,AMA1发挥重要作用。但目前关于鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)子孢子顶膜抗原1(Et AMAl)的功能的相关报道较少。本研究探索了Et AMA1胞外域重组蛋白(Ecto AMA1)亲和配体在球虫感染中的抑制作用。1. 以纯化并复性的原核重组Ecto AMA1蛋白为靶蛋白,利用噬菌体十二肽库对其进行四轮生物淘选。从第四轮洗脱物中随机选出30个噬菌体蓝斑,扩增后提取其核苷酸序列并测序,进而推导出多肽序列。结果显示:对靶分子进行四轮筛选后,得到5种亲和力较高的十二肽。选取高亲和力的两条多肽序列进行合成,命名为L肽和C肽,即为LPSYPGYYQITI(L)和CWTISLFGGVTQ(C)。间接ELISA结果表明,所合成两多肽与重组Ecto AMA1蛋白及Et AMA1蛋白均能够特异性结合。竞争ELISA结果表明,抗Ecto AMA1重组蛋白多克隆抗体能够抑制亲和噬菌体与重组Ecto AMA1的结合。2.对L肽和C肽体外抑制子孢子入侵细胞能力进行评价。首先用MTT法检测L、C两多肽对MDBK细胞的最大无毒浓度,确定最大无毒浓度为125μg/m L。使用pecoll梯度离心法纯化E.tenella子孢子,得到较为纯净的E.tenella子孢子,用CFDA-SE荧光探针标记纯化后的子孢子,利用标记有绿色荧光的子孢子(3×10~5个/孔)入侵MDBK(铺板量1×10~5个/孔)细胞10h,流式细胞仪检测多肽L、C分别在浓度为25μg/m L、50μg/m L、75μg/m L、100μg/m L、125μg/m L时抑制子孢子入侵的作用。结果表明:L肽及C肽对子孢子入侵MDBK细胞均具有一定的抑制作用。在不同浓度梯度下L肽作用均显著或极显著高于C肽(P0.05或P0.01)。3.对L肽和C肽体内抗球虫感染作用进行评价。1日龄雏鸡40只随机分为4组,每组10只,分别为PBS组、L肽处理组、C肽处理组以及攻虫对照组。21日龄时,L组、C组、攻虫对照组鸡每只口服感染1×10~4个E.tenella卵囊,在感染后0~2天(子孢子繁殖期),L组口服L肽对应阳性噬菌体,每只每天1×10~(12 )pfu;C组口服C肽对应噬菌体,每只每天1×10~(12)pfu。攻虫后第8天剖杀全部鸡只,检测鸡增重变化、盲肠病变计分、盲肠眼观病变及病理组织病变、OPG及ACI等评价指标。结果显示:L组、C组各项指标均显著优于攻虫对照组(P0.05),L组与C组相比,L组各项指标均稍优于C组。PBS组、L组、C组、攻虫对照组抗球虫指数分别为200、164.45、153.64、119.45。4.应用Swiss-Model软件对Et AMA1进行三维模建。利用Autodock 4.2软件分别对L肽与Et AMA1、C肽与Et AMA1进行分子对接分析,研究Et AMA1在空间上与L肽和C肽结合方式。结果显示:同源建模评分达90分以上,模型结果合理可靠。L肽、C肽的氨基酸与Et AMA1活性中心氨基酸间均存在分子间氢键作用力与疏水作用力,L、C肽在空间上均能够与Ecto AMA1良好结合。综上,本实验结果表明,筛选出的两个Ecto AMA1重组蛋白亲和配体可以与Et AMA1良好结合,能够抑制E.tenella子孢子入侵宿主细胞并在抗球虫感染中起到一定的保护作用。研究为基于Et AMA1的鸡球虫病相关多肽疫苗研制提供了参考。
[Abstract]:In this study , it is urgent to find new drug target molecules to develop new drugs . However , the study of parasitic protozoans such as Plasmodium falciparum and Toxoplasma gondii plays an important role in the invasion of host cells . The results showed that the maximal non - toxic concentration of L - peptide and C - peptide was higher than that of C - peptide ( P0.05 or P0.01 ) . The results showed that both the amino acids of the L - peptide , the C - peptide and the active central amino acid of Et _ ( 1 ) were able to bind to the same . The results showed that both the amino acids of the L - peptide , the C - peptide and the active central amino acids of Et _ ( 1 ) had a good binding effect .
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.31

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 蔡秀清;刘丹丹;宿世杰;王乐乐;贾传礼;许金俊;陶建平;;毒害艾美耳球虫第二代裂殖子cDNA文库的构建[J];中国动物传染病学报;2015年05期

2 马俊俊;刘永生;丁耀忠;周建华;高宗良;陈豪泰;马丽娜;张杰;;Dpl蛋白和PrP蛋白与Flotillins蛋白相互作用的酵母双杂交技术分析[J];中国兽医科学;2013年03期

3 陈海珍;胡忠义;李连青;杨华;;噬菌体展示技术在病原体血清学检测中的应用研究进展[J];中国预防医学杂志;2013年02期

4 郑蓉;吕暾;;毒素DON单链抗体的同源建模及与DON结合的分子模拟研究[J];化学学报;2011年23期

5 厉艳;陈长法;赵文军;封立平;邵秀玲;尼秀媚;吴兴海;;噬菌体展示技术及其应用[J];植物检疫;2011年04期

6 蔡炯;钟彦伟;荆霞;陈丽;李方;徐东平;;噬菌体展示技术筛选甲型H1N1流感病毒抗原模拟表位的研究[J];解放军医学杂志;2010年01期

7 吕雪峰;任锐;穆国东;苏双;许志林;;噬菌体展示文库技术及在疫苗研制中的应用现状[J];吉林畜牧兽医;2010年01期

8 康晓平,杨保安,赵慧,祝庆余;从噬菌体库中筛选抗SARS病毒S蛋白的Fab中和活性抗体研究[J];中华微生物学和免疫学杂志;2005年08期

9 杨清浩,王祥卫,金燕,张立新;噬菌体随机肽库筛选MUC1抗原模拟表位[J];第三军医大学学报;2005年13期

10 黄兵,董辉,沈杰,韩红玉,赵其平;中国家畜家禽球虫种类概述[J];中国预防兽医学报;2004年04期

相关博士学位论文 前4条

1 黄小丹;鸡IL-18堆型艾美耳球虫3-1E-α-tubulin增强型核酸疫苗免疫保护机理[D];东北农业大学;2012年

2 马永生;口服微囊化噬菌体的制备及其在胃肠环境中的稳定性、释放行为和抗菌活性研究[D];大连理工大学;2011年

3 姜连连;柔嫩艾美耳球虫DF-1细胞培养体系的建立及EtSerpin，EtAMA1基因功能的初步研究[D];中国农业科学院;2011年

4 刘明;蛋白质与配体相互作用机理的分子模拟研究[D];北京工业大学;2010年

相关硕士学位论文 前6条

1 王芬;表达鸡柔嫩艾美耳球虫AMA1蛋白的乳酸乳球菌免疫保护作用[D];东北农业大学;2016年

2 冯俪;鸡堆型艾美耳球虫Hsp90增强型核酸疫苗免疫保护研究[D];东北农业大学;2015年

3 李兰兰;鸡氨肽酶N蛋白亲和肽的筛选与生物学活性鉴定[D];东北农业大学;2014年

4 莫平华;青蒿素抗鸡柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子作用机理研究[D];扬州大学;2014年

5 宋萍;青蒿素及柳氮磺胺吡啶对柔嫩艾美耳球虫的防治效果研究[D];扬州大学;2014年

6 潘龙;鸡堆型艾美耳球虫3-1E基因的原核表达及多克隆抗体制备[D];东北农业大学;2008年

，

本文编号：1968872