柔嫩艾美耳球虫Etgam59基因克隆表达与免疫保护性研究

发布时间：2018-06-12 01:13

本文选题：柔嫩艾美耳球虫 + Etgam59基因　；参考：《扬州大学》2015年硕士论文

【摘要】：鸡球虫病是一种严重危害养鸡业的原虫病,呈世界性分布,其病原隶属艾美耳科(Eimeriidae)艾美耳属(Eimeria),世界公认的有7种,其中鸡柔嫩艾美耳球虫(E. tenella)流行最广泛,致病性最强,危害最大。长期起来,鸡球虫病的防治主要依靠药物。但是随着球虫对药物普遍产生了耐药性,使药效不断降低。此外,药物在饲料中长期添加可残留肉蛋,危害人体健康,同时也污染环境。因此,鸡球虫病的疫苗免疫预防越来越受到重视,并被养殖企业所接受。目前,临床上应用的鸡球虫病疫苗有两大类,一类是由数种鸡球虫卵囊组成的活疫苗,另一类是由3种天然的配子体蛋白组成的亚单位疫苗。虽然活疫苗的免疫效果较好,但存在诸多问题,如病原容易扩散、致弱虫株毒力易返强、虫株的抗原变异、疫苗导致饲料报酬降低、疫苗接种的剂量难以控制、免疫后的监测和管理技术要求高等。天然蛋白组成的亚单位疫苗能克服上述缺点,但这类疫苗需从感染鸡体分离纯化配子体,然后再用亲和柱层析的方法分离纯化配子体蛋白,因此生产费时、成本昂贵。利用基因重组技术研制基因工程疫苗可能解决这一难题。柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白EtGAM59是配子体发育阶段特异性表达的一种蛋白,参与卵囊壁的形成。迄今,在国内尚无有该基因的序列报道,其原核表达及其表达产物的免疫保护力等在国内外也未见有报道。为此,本研究在对柔嫩艾美耳球虫配子体Etgam59基因进行克隆和序列分析的基础上,构建了该基因的原核表达质粒并进行诱导表达,对表达产物的免疫原性和免疫保护力进行了评价,并对该基因表达产物在虫体内的定位和功能进行了探究,旨在为鸡球虫病基因工程疫苗的研制奠定基础。1柔嫩艾美耳球虫Etgam59基因的克隆与序列分析分离纯化E. tenella扬州株的配子体,提取总RNA后用RT-PCR方法扩增出Etgam59基因。将目的片段与pGEM-T-Easy载体连接,常规方法转化感受态大肠杆菌DH5α,蓝白斑法筛选阳性克隆,经PCR和EcoR Ⅰ酶切鉴定后测序,用相关软件进行序列分析。结果显示,克隆的Etgam59基因全长为1617 bp,与E. tenella基因组序列中Etgam59进行比较,两者的同源性为99.9%；该基因编码538个氨基酸,经预测软件分析该蛋白存在一个酪氨酸-丝氨酸和脯氨酸-甲硫氨酸富集区,拥有13个抗原决定簇,在酪氨酸一丝氨酸和脯氨酸-甲硫氨酸富集区内含有3个抗原表位。2柔嫩艾美耳球虫Etgam59基因的原核表达与免疫原性分析根据目的基因在去掉信号肽序列后以及表达载体pET-28a(+)的序列特点设计特异性引物,以构建的重组质粒pGEM-T-Easy-Etgam59为模板,经PCR扩增出大小为1569 bp的目的片段,并将其插入到载体pET-28a(+)上,构建成重组表达载体pET-28a(+)-Etgam59,将其转化感受态大肠杆菌BL21 (DE3),经诱导后表达出分子量为61.2 kDa的可溶性蛋白(rEtGAM59);经Western-blot检测,rEtGAM59蛋白能被抗6×HIS标签单抗和鼠抗rEtGAM59蛋白多抗所识别,也能被E. maxima、柔嫩艾美耳球虫(E. tenella)和毒害艾美耳球虫(E. necatrix)的康复血清所识别,显示rEtGAM59蛋白具有抗原性。3柔嫩艾美耳球虫Etgam59基因的定位分析7周龄雏鸡逐只经口感染1×108个E. tenella扬州株孢子化卵囊。感染后96 h、108h、 120 h、132 h、144 h、156 h、168 h分别扑杀雏鸡,取盲肠组织制作石蜡组织切片,分别进行H.E.染色和免疫荧光组织化学染色。结果显示,荧光标记仅出现在大配子体的成壁体和卵囊壁,表明Etgam59基因在配子体节段特异性表达,其表达产物主要位于大配子体的成壁体上,并参与卵囊壁的形成。4重组蛋白rEtGAM59对鸡球虫病的免疫保护力以雏鸡为试验动物,设计了2个试验,以死亡率、相对增重率、盲肠病变值、卵囊产量与卵囊减少率、体液抗体水平等为指标,评价了重组蛋白rEtGAM59的免疫保护效果。结果显示：三个重组蛋白+佐剂免疫组的免疫保护力均低于卵囊免疫组(P0.05),但好于其他各免疫组(P0.05),其中以重组蛋白+佐剂中剂量组免疫效果最好；佐剂免疫组在增重、卵囊减少率等方面相同于重组蛋白免疫组,均接近未免疫攻虫组(P0.05)。
[Abstract]:In this paper , it has been reported that the vaccine has two main types , such as easy diffusion of pathogenic bacteria , low dose of vaccine , and high requirement for immune protection . In addition , the vaccine has two main types , such as easy diffusion of pathogenic bacteria , low dose of vaccine inoculation , and high requirement for immune protection . The results showed that the total length of the cloned Etgam59 gene was 1617 bp , compared with Etgam59 in E . tenella genome sequence , and the homology was 99.9 % .
The recombinant plasmid pET - 28a ( + ) - Etgam59 was transformed into competent E . coli BL21 ( DE3 ) . The recombinant plasmid pET - 28a ( + ) - Etgam59 was transformed into competent E . coli BL21 ( DE3 ) . The results showed that the immune protective effects of the three recombinant protein + adjuvant immune groups were lower than those in the immunized group ( P0.05 ) , but better than other immune groups ( P0.05 ) . The results showed that the immune protective effect of the recombinant protein rEtchant 59 was the best in the dose group of the recombinant protein + adjuvant .
The immune group of adjuvant was similar to the recombinant protein immune group in the aspects of weight gain , egg sac reduction rate and so on , which were close to the unvaccinated group ( P0.05 ) .
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.31

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