双峰驼ALNA的免疫与微生物屏障特征及其蛋白组学研究

发布时间：2018-06-15 14:05

本文选题：双峰驼 + ALNA　；参考：《甘肃农业大学》2017年博士论文

【摘要】：皱胃淋巴集结区(Aggregated lymphoid nodules area,ALNA)是2003年王雯慧教授首次发现于双峰驼皱胃的特有器官化黏膜相关淋巴组织。为明确双峰驼ALNA免疫与微生物屏障特征及其对局部黏膜免疫的作用机制,本研究以阿拉善双峰驼为研究对象,将其分为5组,即胚胎组(约10~13月胎龄)、幼年组(1~2岁)、青年组(3~5岁)、壮年组(6~16岁)和老年组(17~20岁),进行了以下4个方面的研究:(1)首先采用免疫组织化学、图像分析及统计等方法,详细观察形成免疫屏障的主要效应细胞IgA~+和IgG~+细胞在不同年龄双峰驼ALNA不同区域的分布特点和规律。结果表明,胚胎时期的ALNA中无IgA~+和IgG~+细胞分布。而在其他4个年龄组这两类细胞均弥散分布于其固有层内,并且它们在圆顶区的密度分别显著低于其在非圆顶区的密度(P0.05)。同时,除胚胎组外的每一年龄组中,IgA~+与IgG~+细胞密度在圆顶区差异不显著(P0.05);IgA~+细胞密度在老年组的非圆顶区显著低于IgG~+细胞密度(P0.05),而其他年龄组非圆顶区中的统计结果却与此相反(P0.05)。更重要的是,在老年组,IgA~+细胞在圆顶区和非圆顶区的密度都分别显著低于幼年组和青年组相应部位(P0.05);而IgG~+细胞在非圆顶区密度分别显著低于幼年组和青年组的相应部位(P0.05),而在圆顶区其显著低于幼年组(P0.05)。研究结果提示,IgA~+和IgG~+细胞主要分布于效应区,该分布特点与其分泌的抗体形成免疫防御屏障密切相关,且衰老可显著降低两类细胞密度,但不改变两类细胞弥散分布的特征。少量分布于诱导区的IgA~+和IgG~+细胞与免疫记忆关系密切,衰老也使其分布密度均显著下降。(2)采用组织学、免疫组织化学、图像分析及统计学等方法,研究探讨了IgG的转运受体FcRn在ALNA的表达规律及增龄性变化特点。结果表明,从胚胎组到老年组该区域的上皮细胞均表达FcRn,而且在ALNA发育成熟后,FcRn在非圆顶区上皮的表达显著高于在圆顶区上皮的表达(P0.05);此外,FcRn还表达于ALNA的血管内皮、平滑肌和次级淋巴滤泡中巨噬细胞与树突状细胞。在老龄组,FcRn的表达量迅速下降,但仍高表达于次级淋巴滤泡中的巨噬细胞和树突状细胞。研究结果提示,在双峰驼ALNA中,FcRn虽然在胚胎到老年的黏膜免疫诱导部位—滤泡相关上皮有所表达,但主要表达于黏膜免疫效应部位—非黏膜相关上皮,同时还表达于各年龄次级淋巴滤泡中的巨噬细胞和树突状细胞。(3)本文在前期研究基础之上,选择alna最发达的青年驼,基于微生物16srdna高通量测序技术,对alna黏膜表面的微生物屏障结构进行了分析并与其在回肠淋巴集结(peyer’spatches,pps)之间的差异进行比较。分析结果显示:双峰驼alna具有很高的细菌多样性,从双峰驼alna的网格区、纵行区及回肠pps区中共鉴定到18门、30纲、61目、61科、68属类的细菌。拟杆菌门、厚壁菌门、疣微菌门和变形菌门为其优势菌门,且在不同部位之间没有差异;而纤维杆菌门、迷踪菌门和螺旋体门在网格区和纵行区的丰度显著高于回肠pps区,梭杆菌门在回肠pps区的丰度显著高于网格区和纵行区。在科的分类水平上,普雷沃氏菌科、瘤胃菌科、毛螺旋菌科、韦荣球菌科、bs11、食物谷菌科、rf16、拟杆菌科、elusimicrobiaceae、mogibacteriaceae、梭菌科、消化链球菌科、梭杆菌科为共同优势菌科,且不同部位之间没有显著差异。而纤维杆菌科、韦荣球菌科、弯曲杆菌科、螺旋体科、r4-45b、r4-41b、dethiosulfovibrionaceae在网格区和纵行区的丰度显著高于回肠pps;肠杆菌科、疣微菌科、理研菌科、barnesiellaceae、odoribacteraceae、产碱菌科、脱铁杆菌科、消化球菌科和turicibacteraceae在回肠pps的丰度显著高于网格区和纵行区。研究结果提示,在alna黏膜定植的菌群与回肠pps区定植的菌群虽然在门水平几乎无差异,但在科的分类水平上有较大的不同。(4)基于itraq定量蛋白质组学技术,对青年双峰驼alna的网格区、纵行区和回肠pps区表达的总蛋白及差异蛋白进行定量分析,并对其进行go、cog和kegg注释和富集。结果显示,鉴定到的总蛋白数为2513,其中网格区与纵行区相比,鉴定到60个差异蛋白,在网格区其中37个表达较高,23个较低;网格区与回肠pps相比,鉴定到67个差异蛋白,其中38个表达较高,19个较低;而纵行区与回肠pps相比,鉴定到111个差异蛋白,其中67个表达较高,44个较低。对总蛋白进行kegg路径分析,这些蛋白被注释到与免疫相关的路径主要包括细胞的骨架调控以及免疫细胞分化、黏附、迁移、fcγr调节的吞噬、抗原的加工和处理等31条路径。对差异蛋白基于kegg数据库进行代谢路径富集,主要比对了如下路径中的关键蛋白:在处理与提呈抗原过程相关的蛋白,包括mhc-Ⅱ、β2m、cd4、MHC-Ⅰ、CD8、CD74和ICAM-1;T细胞激活的相关蛋白,包括鸟苷酸置换因子1(Vav1)、T细胞淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tiam1)、肌动蛋白多聚化调节分子(RhoA)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、丝氨酸苏氨酸激酶(AKT)和鸟氨酸释放蛋白(Ras);T细胞-B细胞受体路径中的相关蛋白,包括CD21、CD22、鸟苷酸置换因子(VAV)、CD40L以及CD45;以及主要的黏附分子α4β7及配体VCAM-1和MAdCAM。研究结果证明,双峰驼ALNA的网格区和纵行区与回肠PPs在涉及抗原摄取、加工、处理,T细胞和B细胞激活以及淋巴细胞的趋化与归巢等关键蛋白的整体表达水平较为接近,但也存在局部差异。本研究证明,双峰驼ALNA的免疫与微生物屏障特征及其对局部黏膜免疫的作用呈现以下基本特征:(1)IgA~+和IgG~+细胞弥散分布于ALNA效应区是其最为显著的特征之一,该特征对于IgA及IgG在该区形成完整的保护屏障具有重要意义;(2)除SIgA为黏膜免疫主效应分子外,IgG也具备参与黏膜免疫稳态维持的条件。同时,衰老可降低IgA~+和IgG~+细胞的分布密度及FcRn的表达水平;(3)定植在ALNA黏膜的优势菌群与其在回肠PPs黏膜中相同,但其组成结构存在一定差异;(4)ALNA的蛋白质表达谱与回肠PPs之间具有很大的相似性,但其参与细胞骨架调控及抗原摄取等相关蛋白的表达水平存在一定的差异。这为研究衰老对胃黏膜免疫稳态维持的影响提供依据,也为进一步揭示ALNA在消化道黏膜免疫中的地位奠定了基础。
[Abstract]:The results showed that IgA ~ + and IgG ~ + cells were significantly lower than those in the young group ( P0.05 ) . The results showed that IgA ~ + and IgG ~ + cells were significantly lower in the dome area than in the young group ( P0.05 ) . ( 2 ) The expression and age - related changes of the transport receptor of IgG were studied by means of histological , immunohistochemical , image analysis and statistics . The results showed that the expression of FRs Rn in the non - dome area was significantly higher than that in the epithelium of the dome area after the development of ALNA . ( 3 ) On the basis of the previous research , we selected alna ' s most developed camel , analyzed the microbial barrier structure of alna mucosa on the basis of 16srdna high - throughput sequencing technology . The results suggested that although there was almost no difference in the levels of bacteria between alna mucosa and ileum pps , there was a great difference in the classification level of the family . ( 4 ) Based on itraq quantitative proteomic technique , a quantitative analysis of the total protein and differential protein expressed in the grid area , longitudinal area and ileum pps region of alna in young Bactrian alna was performed . ( 1 ) IgA ~ + and IgG ~ + cells are the most prominent feature in the formation of intact protective barrier .
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S824

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