酵母双杂交筛选环形泰勒虫P104蛋白相互作用蛋白

发布时间：2016-12-02 18:45

本文关键词：传播牛泰氏焦虫病的白纹璃眼蜱，由笔耕文化传播整理发布。

《新疆农业大学》 2014年

岑双庆

【摘要】：环形泰勒虫是顶复门的一种蜱传性血液寄生虫，能使牛淋巴组织增生并引起牛的热带泰勒虫病，给亚洲和非洲等疾病流行地区造成了巨大的经济损失。据报道，环形泰勒虫主要侵染巨噬细胞、单核细胞和B淋巴细胞，能转化宿主细胞，诱导宿主细胞不受控制的增生，并抵制其凋亡。环形泰勒虫对宿主细胞的入侵是由一系列蛋白相继介导的，其中，与真核生物溶酶体功能类似的棒状体，作为顶复门寄生虫的特异性分泌器官，分泌了棒状体-微线体蛋白p104，该蛋白为研究环形泰勒虫的入侵机制和对宿主细胞的转化提供了突破口。 1.环形泰勒虫p104基因全长序列的hiTAIL-PCR扩增本实验采用高效热不对称交互PCR（hiTAIL-PCR）方法，从TaIM细胞系的cDNA中扩增出了p104基因的侧翼序列，通过拼接得到了一个p104基因全序列。BLAST分析发现，与报道过的环形泰勒虫安卡拉株具有95%的相似性。 2.环形泰勒虫p104蛋白的原核表达和亚细胞定位分析将环形泰勒虫p104蛋白的470-650位残基进行了原核表达。将表达后的蛋白纯化之后免疫家兔，制备该蛋白的多克隆抗体。利用间接免疫荧光法对p104蛋白进行了亚细胞定位分析，结果显示该蛋白主要分布于环形泰勒虫裂殖体的表面。结果表明该蛋白适合用于研究与宿主淋巴细胞之间的相互作用。 3. TaIM细胞系酵母双杂交文库的构建和p104诱饵质粒的构建以TaIM细胞系为材料，，构建了该细胞系的酵母cDNA文库。文库构建结果显示，该文库库容量达2.4×107，平均插入的长度在1000bp左右，达到试剂盒要求。通过RT-PCR从中获得p104基因片段，构建酵母双杂交诱饵质粒。结果表明诱饵质粒构建成功，重组蛋白对酵母Gold菌株没有自激活性和毒性作用。 4．酵母双杂交筛选与p104蛋白相互作用的蛋白和相互作用蛋白的验证酵母双杂交筛选出了14个存在潜在相互作用的蛋白。选取最具研究价值的半乳糖凝集素（Bostaurus lectin, galactoside-binding, soluble,1，Gal-1）、热休克蛋白70（Bos indicus partial HSP70gene）进行了回交验证，结果显示这两种蛋白与p104之间确实存在相互作用。经过后期的生物信息学分析，将牛半乳糖凝集素-1的相互作用区域定位在了91-183位氨基酸残基处，HSP70相互作用区域定位在了435-500位氨基酸残基处。

【关键词】：
【学位授予单位】：新疆农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：S852.7
【目录】：

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