磁性纳米颗粒精子介导构建PID1转基因猪

发布时间：2018-06-16 07:01

本文选题：PID1 + 磁性纳米颗粒　；参考：《山东农业大学》2015年硕士论文

【摘要】：养猪生产是世界动物产业的重要组成部分。随着全球经济的发展,猪肉品质已经引起了消费者和生产者的广泛重视。规模化养猪生产已经造成肉质变差,肌内脂肪降低。肉质是畜牧生产中最重要的经济性状之一。提高猪肉品质,对于养猪业有着十分重要的意义。肌内脂肪,即大理石纹,是影响肉质的最重要指标之一,影响肉的嫩度、多汁性以及口感。众多研究结果表明:磷酸络氨酸互作结构域1(PID1)基因的表达与肌内脂肪沉积有关,PID1基因是脂肪沉积的候选基因。随着生物技术的发展,转基因技术得到快速发展,它已经是生产用于科研、农业生产以及疾病控制的基因修饰动物的一个非常有利的工具。精子介导转基因是基于精子细胞的特有能力来结合、内化外源DNA,然后通过受精作用将其转入卵内。精子介导转基因技术与其他方法相比,有着高效率、低成本、简便操作等主要优势,不需要胚胎操作或是昂贵的实验设备。磁性纳米颗粒作为把药物或基因转染指定目标细胞或组织的方法,已经得到广泛研究。磁性纳米转染是一种简单、通用、高效的基因转移方法。本试验中,PEI包被的磁性纳米颗粒被用来作为基因转移的介质来转染精子,之后,经过转染的精子用来介导转基因。我们获得了PID1高表达的转基因猪,并进行了检测。主要结果如下:1.将实验室前期构建成功的pIRES2-AcGFP1-PID1真核表达载体与磁性纳米颗粒polyMAG-1000室温共孵育10 min,之后将磁性颗粒-质粒混合物与精液室温共孵育30min,将转染后的精液通过人工授精方式对3头母猪进行授精,生产转基因猪F0代。2.PCR和Southern blot被用来检测外源基因。本试验F0代共获得仔猪37头,阳性个体(PCR和Southern blot共阳性)13头,阳性率35.13%。其中,获得24头活仔猪,阳性个体7头,阳性率29.16%。3.荧光定量PCR和Western blot检测显示目的基因PID1在转基因阳性猪的表达要高于阴性猪。结果发现在背最长肌组织和肝脏组织中,转基因阳性猪PID1基因的表达量显著高于阴性猪(P0.05);在背膘、肾脏组织中两者表达差异不显著(P0.05)。PID1蛋白的检测结果与PID1的mRNA表达量的结果一致:背最长肌组织和肝脏组织中,阳性组与阴性组相比蛋白表达量显著升高(P0.05)。4.建立利用SYBR Green I实时荧光定量PCR法来检测转基因猪外源基因整合拷贝数的方法。以4头F0代试验猪为研究对象(2头转基因阳性猪,2头阴性猪),以转铁蛋白受体基因为内参基因,通过SYBR Green I实时荧光定量PCR建立针对外源基因GFP和内参基因的双标准曲线和方程。对转基因猪基因组DNA中外源基因和内参基因的拷贝数同时定量检测,外源基因与内参基因起始模板拷贝数的比值即为外源基因在转基因猪中的整合拷贝数,同时利用Southern blot进行验证分析。结果显示,实时荧光定量PCR法检测2头转基因阳性猪外源基因拷贝数分别为3和2,2头转基因阴性猪外源基因拷贝数均为0,结果同Southern blot检测一致。本试验证明实时荧光定量PCR法高通量、灵敏、方便,可以更好的用于转基因猪外源基因整合拷贝数的检测。5.以4头F0代试验猪为研究对象(2头转基因阳性猪,2头阴性猪)进行肉质测定,结果显示:在pH1,pH24、滴水损失、烹饪损失、肉中水分、干物质方面,阳性猪与阴性猪相比较差异均不显著(P0.05)。在剪切值上,阳性猪比阴性猪要大且差异显著(P0.05)。肌内脂肪含量阳性组显著高于阴性组,差异显著(P0.05),说明PID1基因与肌内脂肪的沉积有关。
[Abstract]:Sperm mediated transgenosis is one of the most important economic characters in animal husbandry . A double standard curve and equation for exogenous gene GFP and internal reference gene were established by SYBR Green I real - time fluorescence quantitative PCR .
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S828

【二级参考文献】