鸡精子发生过程中关键piRNAs及Piwill基因功能初步研究

发布时间：2018-06-29 22:58

本文选题：鸡 + piRNAs　；参考：《扬州大学》2017年博士论文

【摘要】：生殖系细胞担负着遗传信息的世代传递,其基因组特性、表达与调控模式对个体及物种维持都至关重要。作为一半的遗传信息载体的精子在家禽中一直未受到足够关注。但是近年来,鸡繁殖力持续下降的问题始终困扰着产业的发展。地方鸡种中每年有5～12%的公鸡因精子发生障碍症而遭淘汰。在现代商业品种中,种公鸡的精子质量导致出苗率逐年下降。另外,由精子介导的细菌微生物(白痢沙门氏菌、空肠弯曲杆菌等)与病毒性疾病(禽白血病、EDS-76等)逐年上升,其中,困扰产业多年的“两白”(白痢与白血病)至今尚未解决。因此,研究鸡精子发生及其影响机制成为当下迫切解决的问题之一。piRNA(Piwi-interacting RNA)是一类长度约为30 nt左右的小RNA,与PIWI蛋白家族成员结合发挥调节作用。在小鼠、果蝇、斑马鱼等模式动物中,PIWI/piRNAs复合物引起的基因沉默能调控生殖干细胞增殖、分化以及精子发生;但在家禽中,PIWIpiRNAs的研究报道甚少,其具体作用与功能尚未阐明。鉴于此,本研究以中国地方鸡种——狼山鸡为对象,分别从精子发生的不同阶段生殖系细胞small RNAs表达谱、与鸡PIWI蛋白特异结合的piRNAs表达与分析、piRNAs与靶基因的作用关系、减数分裂中Piwi基因作用及敲除Piwi基因后个体精子发生变化等方面来揭示家禽精子发生过程中Piwi基因与piRNAs的可能作用与具体功能,从而为探明Piwi基因及piRNAs在禽类中的生物学功能与改善家禽繁殖力提供理论依据,也为丰富生殖细胞和精子发生的表观遗传调控机制研究增添新的资料。为探究参与鸡精子发生及生殖干细胞增殖相关的piRNAs,本研究利用深度测序技术获得不同生殖干细胞(PGCs、SSCs)与生精细胞(Sa、Sperm)的small RNAs表达谱。结果发现,鸡piRNAs主要集中在31～33nt之间,比小鼠中的piRNAs略长,主要定位于编码基因序列及转座子区域;碱基偏好性分析表明鸡piRNAs均表现出首碱基为U,第10位为A(1U-10A)的特征,并且Sa细胞与Sperm中piRNAs的碱基偏好性更为明显。另外,在Sa细胞及Sperm中预测到大量piRNAs簇,分别定位于不同染色体中。由此推测鸡的piRNAs与小鼠piRNAs类似,对于精子发生有重要调控作用。通过不同生殖系细胞的单独比较以及组间比较(PGCs vs.SSCs;Sa.vs.Sperm)富集到一批与鸡精子发生及生殖干细胞增殖相关的piRNAs及其靶基因。对靶基因进行GO富集后得到5个候选靶基因:尤IT,SMAD6,SCX,PGR和 GGNBP2。与这些靶基因对应的 piRRNAs 有:piR-gga-19128(KIT),piR-gga-403821(SMAD6,SCX),piR-gga-123686(PGR),piRNA-396(GGNBP2)。同时,通过KEGG富集到的信号通路有:Melanogenesis,Notch signaling pathway,Steroid hormone biosynthesis,Cytokine-cytokine receptor interaction,Wnt signaling pathway 与 TGF-beta signaling pathway。为验证禽类piRNAs与PIWI蛋白结合状况以及共同参与鸡精子发生及生殖干细胞增殖、分化的可能作用,本研究利用免疫沉淀技术结合深度测序技术获得PGCs、SSCs与Sperm的small RNAs表达谱。长度分析表明,与PIWIL1蛋白结合的piRNAs主要集中于31～33nt;碱基偏好性同样表现为“1U-10A”特征,并且Sperm中的碱基偏好性比PGCs、SSCs明显,上述分析结果均与前期研究结果一致,由此表明,鸡piRNAs确实与PIWI蛋白相互结合并共同参与调控鸡精子发生与生殖干细胞增殖与分化。通过三种细胞的venn分析筛选出一批与PIWI蛋白结合且参与精子发生及生殖干细胞增殖的piRNAs:piRNA-19128、piRNA-70672,piRNA-64217,piRNA-139648。通过靶基因注释及GO富集分析获得候选靶基因有:KIT、SRC、WNT4、HMGB2。KEGG富集分析获得以下信号通路:Steroid hormone biosynthesis,Notch signaling pathway,Melanogenesis.综合以上两部分piRNAs的分析结果,通过Venn分析进一步发现piRNA-19128为二者交集,因此选取piRNA-19128为鸡关键piRNAs进行功能验证。研究表明KIT基因参与精子发生过程,并且对减数分裂发挥重要调控作用。因此,选取piRNA-19128对应的靶基因KIT作为候选功能验证对象。为进一步验证piRNAs与KIT基因的靶向调控关系,首先利用RT-qPCR技术检测了 PGCs、SSCs、Sa及Sperm中KIT与piRNA-19128的表达量,结果表明,在SSCs与Sperm中,KIT基因表达量相对较高,但piRNA-19128表达量相对较低;l在PGCs及Sa中piRNA-19128表达量相对较高,但KIT基因表达量相对较低,且均达到显著差异水平(P0.01)。由此推测,piRNA-19128与KIT基因可能存在靶向抑制关系。其次,利用piRNAs-19128模拟物与抑制物结合RT-qPCR技术检测piRNA-19128的表达量。结果发现,转染piRNA-19128 mimics与inhibitor至DF-1细胞后,随mimics的转染浓度增加,piRNA-19128的表达量随之增加,KIT基因表达量随之降低;随inhibitor的转染浓度增加,piRNA-19128的表达量随之降低,KIT基因表达量随之增加。双荧光素酶荧光活性检测进一步发现,突变型KIT基因荧光活性与野生型荧光活性相比,突变型显著高于野生型(P0.01)。综上表明,piRNA-19128与KIT基因确实存在靶向调控关系,并且piRNA-19128抑制KIT基因的转录,从而参与精子发生过程中的减数分裂。为探明PIWI蛋白与piRNAs如何调控鸡精子发生,我们选择精子发生过程中关键事件—减数分裂作为功能研究平台,探讨编码鸡PIWI蛋白的Piwill(Piwi like-1)基因、KIT基因与piRNA-19128在减数分裂中的作用。本研究利用维甲酸诱导PGCs细胞,通过RT-qPCR、Western Blot及流式细胞分析技术检测诱导过程中PiwillmRNA及蛋白水平的变化。有研究表明,Piwil1基因在圆形精细胞中表达量最高,精原细胞次之,推测Piwil1基因参与减数分裂,并发挥重要调控作用。分别收集诱导48h、96h、144h的样品,通过检测减数分裂标志基因Stra8的表达,结果发现,随诱导时间的增加,Stra8基因的表达量显著增加;流式分析诱导144h的细胞,表明44.9%的细胞形态发生变化,由二倍体变为单倍体,由此推断细胞进入减数分裂状态。通过检测不同时间点Piwill基因、KiT基因与piRNA-19128的表达量,表明随诱导时间的增加,Piwil1、KIT、piRNA-19128的表达量增加;PIWIL1蛋白水平检测表明,随诱导时间的增加,PIWIL1蛋白表达增加。由此推断,在禽类中,Piwil1基因、KIT基因与piRNA-19128参与鸡精子发生过程并调控减数分裂。为阐明PIWI/piRNAs复合物在家禽(鸡)精子发生的具体功能,本研究利用CRISPR/Cas9技术在体内、体外水平分别对Piwil1基因进行敲除。首先针对Piwil1基因第八外显子分别构建3条敲除载体,通过转染DF-1细胞后使用T7E1酶切及PCR扩增、测序表明2号位点可发挥敲除活性。利用有活性载体转染DF-1细胞,结合有限稀释法得到58株单克隆细胞,PCR扩增靶位点测序表明2株细胞为阳性细胞,一株共缺失23 bp,另一株共缺失8 bp。由此表明,利用该技术成功构建Piwil1敲除细胞株,敲除效率为3.44%,略低于大鼠的敲除效率。在体内水平,利用胚下腔注射法将敲除载体导入孵化2.5日龄的鸡胚个体,分别检测5日龄(心脏、生殖嵴)及18日龄(心脏、睾丸)不同组织中Piwil1基因DNA及RNA水平的突变情况。结果发现,在5日龄及18日龄的各个组织中,敲除位点附近均出现不同程度的突变。RT-qPCR结果显示,实验组中Piwil1基因及SOX2基因表达水平显著低于对照组(P0.01),表明敲除载体成功导入鸡胚个体发挥敲除作用。对敲除后F0代雏鸡进行饲养并检测其体重及精子活力,结果显示敲除组群体体重与对照组无差异(P0.05),表明敲除Piwil1基因对个体体重无影响。精液品质检测表明敲除Piwil1基因后,鸡精子活力、活率下降,云雾状不明显,精液量显著减少。对F0代实验鸡群进行本交得到F1代,PCR扩增靶位点并测序表明,10只个体发生Piwil1基因突变。综上表明,在家禽中Piwil1基因参与精子发生,并在其中发挥重要的功能;CRISPR/Cas9技术适用于家禽基因组修饰,并且其修饰效果可遗传。
[Abstract]:In order to study the effects of Piwi gene and pirRNAs on the proliferation , differentiation and spermatigenesis of reproductive stem cells , it is found that the expression of Piwi gene and pirRNAs in poultry has not yet been solved . In order to verify the binding status of piRNAs and PIWI protein and to participate in the proliferation and differentiation of reproductive stem cells , pir - gga - 403821 ( SMAD6 , SCX ) , piR - gga - 403821 ( SMAD6 , SCX ) , piR - gga - 403821 ( SMAD6 , SCX ) , piR - gga - 403821 ( SMAD6 , SCX ) , piR - gga - 123686 ( PCR ) , piRNA - 396 ( GGNBP2 ) were obtained . The expression of piRNA - 19128 was significantly higher than that of wild type ( P0.01 ) . The expression of Piwil1 gene , KIT and piRNA - 19128 in different tissues of poultry ( chicken ) was detected by using the technique of CRISPR / Cas9 . The results showed that the body weight of the knock - out group was not different from that of the control group ( P0.05 ) .
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S831

【相似文献】