FAM3A基因转录调控分析及其在脂肪生成中的作用研究

发布时间：2018-07-03 12:17

  本文选题：FAM3A + 脂肪细胞分化　； 参考：《华中农业大学》2015年硕士论文

【摘要】：FAM3A是蛋白质序列相似度为3的细胞因子家族成员之一,它在肝脏中受到PPARG调控,参与脂肪代谢。本实验旨在研究FAM3A在前体脂肪细胞中的转录调控机制及其在脂肪细胞分化过程中的调控作用。主要研究结果如下：1.在3T3L1细胞中过表达C/EBPbeta,检测FAM3A基因表达量变化,发现C/EBPbeta能促进FAM3A表达(P0.01)。2.构建FAM3A启动子缺失双荧光报告载体D1(-1478/+46)、D2(-1187/+46)、D3 (-951/+46)、D4 (-442/+46)、D5 (-285/+46)和D6 (-32/+46),分别转染3T3L1、C2C12和CHO三种细胞,检测荧光活性,结果FAM3A启动子各缺失在三种细胞中都有活性且有相似活性趋势,D5(-285/+46)活性最高,D6(-32/+46)活性最低,只有基本启动子活性。由此推断核心启动子位于-32bp至+46bp区域,-285bp至-32bp区域是启动子正向调控元件富集区,而-1478bp至-285bp区域分布着较多的抑制启动子活性的元件。3.将C/EBPbeta真核表达载体与FAM3A启动子各缺失共转染,FAM3A启动子各缺失活性显著增强(P0.01),其中C/EBPbeta对缺失片断D-118,7/+46的作用最显著(P0.01),将D-1187／+46活性提高了3.55倍。继续将启动子上C/EBPbeta结合位点定点突变并与C/EBPbeta真核表达载体共转染3T3L1细胞,结果突变启动子活性几乎不受C/EBPbeta影响。接着应用EMSA实验进一步证明C/EBPbeta蛋白能与启动子上C/EBPbeta结合位点结合。4.构建FAM3A真核表达载体并转染3T3L1细胞,用MDI诱导3T3L1细胞分化,结果该细胞成脂分化效率受到FAM3A抑制,分化8天后甘油三脂含量显著降低。检测脂肪分化标志基因表达情况,发现同对照组相比,PPARG2和FABP4在FAM3A基因在细胞分化2天后表达量显著下调(P0.05),C/EBPα/SCD1、 DGAT1、LPL和FABP4基因在分化8天后下调表达,并达到显著水平(P0.05)。FAM3A基因在3T3L1细胞分化8天后对HSL、ACC2、AdipoR1、FAS, ACOX1和UCP2基因表达没有影响。5.将FAM3A真核表达载体转染3T3L1细胞,72小时后收集细胞测定细胞周期,结果实验组的G1期细胞数量从63.5%上升到72.7%,同时S期占的细胞比例从24.8%下降至18.3%,两组细胞的G2期细胞数量没有显著差异,表明FAM3A能抑制3T3L1细胞周期。
[Abstract]:FAM3A is a member of cytokine family whose protein sequence similarity is 3. FAM3A is regulated by PPARG in liver and participates in fat metabolism. The aim of this study was to investigate the transcriptional mechanism of FAM3A in precursor adipocytes and its role in adipocyte differentiation. The main results are as follows: 1. The expression of FAM3A gene was detected in 3T3L1 cells. It was found that C / EBP beta could promote the expression of FAM3A (P0.01) .2. The double fluorescent report vector D1 (-1478 / 46) D 2 (-118787 / 46) D3 (-951 / 46) D4 (-442 / 46) D5 (-28546) and D6 (-32 / 46) were constructed and transfected into three kinds of cells, 3T3L1C2C12 and Cho, respectively. Results the deletion of FAM3A promoter had the highest activity of D5 (-285 / 46) and the lowest activity of D6 (-32 / 46) in all three kinds of cells. It is concluded that the core promoter is located in the region of -32bp to 46bp, the region of -285bp to -32bp is the rich region of the positive regulatory element of the promoter, while the region of -1478bp to -285bp distributes more elements that inhibit the promoter activity. The deletion activity of C / EBPbeta and FAM3A promoter was significantly increased (P0.01), and the activity of D-1187 / 46 was the most significant (P0.01). The activity of D-1187 / 46 was increased by 3.55 times. The C / EBP beta binding site on the promoter was continuously mutated and co-transfected with the C / EBPbeta eukaryotic expression vector into 3T3L1 cells. The results showed that the promoter activity was almost independent of C / EBP beta. Then the EMSA assay was used to further prove that the C / EBP beta protein could bind to the C / EBP beta binding site on the promoter. FAM3A eukaryotic expression vector was constructed and transfected into 3T3L1 cells. The differentiation of 3T3L1 cells was induced by MDI. As a result, the adipogenic differentiation efficiency of the cells was inhibited by FAM3A, and the triglyceride content decreased significantly after 8 days of differentiation. Compared with the control group, the expression of PPARG2 and FABP4 in FAM3A gene was significantly down-regulated 2 days after differentiation (P0.05), the expression of C / EBP 伪 / SCD1, DGAT1 / LPL and FABP4 genes were down-regulated 8 days after differentiation. FAM3A gene had no effect on the expression of HSLACC2AdipoR1 FASA, ACOX1 and UCP2 genes in 3T3L1 cells 8 days after differentiation. FAM3A eukaryotic expression vector was transfected into 3T3L1 cells for 72 hours. Results the number of G1 phase cells in the experimental group increased from 63.5% to 72.7%, while the percentage of S phase cells decreased from 24.8% to 18.3cells. There was no significant difference in the number of G2 phase cells between the two groups, which indicated that FAM3A could inhibit the cell cycle of 3T3L1 cells.
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.2

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本文编号：2093613